Ферменты трипсин и химотрипсин синтезируются в: Трипсин механизм действия — Справочник химика 21

Трипсин механизм действия — Справочник химика 21

    Следует подчеркнуть, что в этом небольшом, казалось бы, химическом процессе — отщепление гексапептида от предшественника-заключено важное биологическое значение, поскольку при этом происходят формирование активного центра и образование трехмерной структуры трипсина, а известно (см. главы 1 и 4), что и белки биологически активны только в своей нативной трехмерной конформации. В том, что трипсин, как и другие протеиназы, вырабатывается в поджелудочной железе в неактивной форме, также имеется определенный физиологический смысл, поскольку в противном случае трипсин мог бы оказывать разрушающее протеолитическое действие не только на клетки самой железы, но и на другие ферменты, синтезируемые в ней (амилаза, липаза и др.). В то же время поджелудочная железа защищает себя еще одним механизмом-синтезом специфического белка ингибитора панкреатического трипсина. Этот ингибитор оказался [c.420]

    Рассмотрим механизм действия фермента и основные стадии ферментативного катализа на примере очень хорошо изученного фермента, химо-трипсина. Это — гидролаза, а точнее — эндопептидаза, расщепляющая такие пептидные связи внутри полипептидной цепи белка, в образовании которых участвует карбоксильная группа ароматических аминокислот. 

[c.30]

    Сравните свойства и механизм действия трипсина, пепсина и карбоксипептидазы карбоксипептидазы и карбоангидразы фруктозодн-фосфат-альдолазы и ацетоацетатдекарбоксилазы. [c.180]

    Другой весьма специфичный тип белок-белкового взаимодействия представлен ингибированием трипсина маленьким белковым ингибитором из поджелудочной железы быка. Последний белок состоит из 58 аминокислотных остатков, образующих весьма компактную структуру, содержащую три дисульфидных связи. Вследствие такой компактности белок не очень чувствителен к протеолитической атаке. Боковой радикал Lys-15, однако, полностью экспонирован и представляет собой участок взаимодействия с трипсином, а также его ингибирования. Обычный каталитический механизм действия сериновых протеиназ , представителем которых является трипсин, предполагает образование нековалентного комплекса, за которым следует ацилирование Ser-195 фермента карбонильной группой лизина или аргинина и высвобождение первого продукта реакции. Завершает процесс деацилирование ацилфермента. 

[c.563]

    В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной (или групповой) и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольщее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного происхождения, несмотря на то что эти белки существенно отличаются друг от друга как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы, ни жиры. Объясняется это тем, что точкой приложения, местом действия пепсина является пептидная —СО—КН-связь. Для действия липазы, катализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, подобным местом является сложноэфирная связь. Аналогичной групповой специфичностью обладают трипсин, химотрипсин, пептидазы, ферменты, гидролизующие а-гликозидные связи (но не 3-гликозидные связи, имеющиеся в целлюлозе) в полисахаридах, и др. Обычно эти ферменты участвуют в процессе пищеварения, и их групповая специфичность, вероятнее всего, имеет определенный биологический смысл. Относительной специфичностью наделены также некоторые внутриклеточные ферменты, например гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеются и специфические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фосфорилирование (см. главу 10). 

[c.142]

    Механизм действия тромбопластина еще не совсем ясен. Большинство авторов считает, что тромбопластин является ферментом. В пользу этого говорит то, что трипсин также способен вызывать превращение протромбина в тромбин [56]. С этой точки зрения вполне оправдано старое название этого 

[c.181]

    Попытка обобщить данный материал сделана в настоящей книге, которая представляет собой логическое продолжение первой части, опубликованной ранее отдельным томом и посвященной анализу специфичности и кинетических аспектов действия ферментов на относительно простые субстраты, такие как алифатические и ароматические спирты и альдегиды, производные карбоновых кислот, замещенные аминокислоты и их производные (не выше ди- или три-пептидов). Главное внимание в первой части книги уделялось характеру фермент-субстрат ных взаимодействий на достаточно ограниченных участках активного центра и кинетическим проявлениям этих взаимодействий. В основе первой части книги лежит экспериментальный материал, полученный при изучении специфичности, кинетики и механизмов действия цинк- и кобальткарбоксипеп-тидазы, химотрипсина и трипсина из поджелудочной железы быка, алкогольде-гидрогепаз нз печени человека и лошади и пенициллинамидазы бактериального происхождения. Итогом первой части книги явились обобщение и формулировка кинетико-термодинамических принципов субстратной специфичности ферментативного катализа. 

[c.4]

    Таким образом, и механизм каталитического действия, и специфичность к субстрату ферментов можно объяснить свертыванием их полипептидной цепи и положением на ней радикалов. Характер свертывания белковой цепи в трипсине показан на рис. 21-20. Этот фермент построен из одной непрерывной полипептидной цепи, включающей 223 аминокислоты. (В нумерацию аминокислот на рисунке внесены изменения-пропуски и вставки, чтобы привести ее в соответствие с нумерацией в химотрипсине и эластазе.) Молекула трипсина имеет приблизительно сферическую форму диаметром 45 А и чашевидное углубление с одной стороны для активного центра. На рис. 21-20 атомы аспарагиновой кислоты, гистидина и серина в активном центре изображены черными кружками. Подлежащая разрыву белковая цепь изображена цветными кружками с черными ободками, а стрелка указывает положение разрываемой связи. Жирные штриховые синие линии с двух концов субстрата указывают, что его цепь растягивается на значительную длину в обоих направлениях. Карман специфичности для радикала R изображен точечными синими линиями в правой нижней части рисунка, и поскольку иллюстрируемой молекулой является трипсин, в карман вставлена аргининовая боковая цепь, притягиваемая отрицательным зарядом аспарагиновой кислоты 189 в нижней части кармана. 

[c.323]

    Раствор версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Раствор версена применяют для снятия слоя выросших клеток со стекла как при работе с перевиваемыми штаммами, так и для получения из первичных культур клеток второй генерации. Особенно большое применение этот раствор получил при постановке цветной реакции. Он оказывает на клетки более мягкое действие, чем раствор трипсина. Механизм действия версена заключается в том, что при добавлении его раствора к пласту клеток он вступает в реакцию со стеклом, образуя промежуточное соединение, которое механическим путем отделяет клетки от стекла и разделяет нх очень мягко друг от друга. Поэтому при обработке клеток раствором версена почти не образуется конгломератов клеток, что очень важно для получения равномерной взвеси. Обычно используют 0,02% раствор версена. 

[c.21]

    Различают ферменты — простые белки, которые при гидролизе дают только аминокислоты. Ферменты-протеины используются в качестве лекарственных и диагностических средств (пепсин, трипсин, папаин, уреаза). Сложные ферменты, как правило, имеют простетическую группу (кофермент) небелковой природы, связанную с белком фермента связью различной степени прочности. Роль коферментов в общем механизме биокатализа настолько важна, что их можно рассматривать как отдельную группу биологически активных веществ с разными механизмами действия. 

[c.204]

    Следовательно, мы можем предположить, что карбоксильная группа аспарагиновой кислоты, соседней с серином активного центра (2-15), не оказывает существенного влияния на каталитический процесс. Как будет показано ниже, предложены механизмы действия химотрипсина, согласно которым карбоксильная группа аспарагиновой кислоты участвует в формировании каталитического центра. Это предположение основывается на том, что для всех ферментов — химотрипсина, трипсина [c.263]

    Токсическое действие. Вне зависимости от форм химических соединений К., поступающего в организм, направленность действия и известные механизмы развития интоксикации близки. Уровень токсичности соединений К. зависит от их типа, растворимости, а также от наличия в веществе других биологически активных элементов. Достижение близкого токсического эффекта при введении различных соединений К. связывают в основном с количеством свободных ионов Сё . Существует предположение о биологической конкуренции К. с цинком, которая определяет характер многих изменений в организме под воздействием К., а также протекторное действие цинка при кадмиевой интоксикации. Установлено, что металлы (цинк, селен) модифицируют токсические эффекты К., очевидно, в результате конкуренции за связывание с определенными биологическими субстратами. К. снижает активность пищеварительных ферментов — трипсина и, в меньшей степени, пепсина. В экспериментах установлено, что К. подавляет отдельные звенья иммунной защиты организма. 

[c.445]

    Будучи сходными по структуре и механизму действия, эти ферменты поразительным образом различаются по специфичности. Субстрат химотрипсина должен иметь ароматическую или большую неполярную боковую цепь. Для трипсина требуется субстрат, содержащий лизин или аргинин. Ни один из этих субстратов не пригоден для эластазы, проявляющей специфичность в отношении небольших незаряженных боковых цепей. Как показал рентгеноструктурный анализ, эта разница в специфичности рассматриваемых ферментов обусловлена очень небольшими структурными различиями участков связывания субстрата (рис. 8.22), В химотрипсине ароматические 

[c.161]

    У простых ферментов активные центры образуются за счет своеобразного расположения аминокислотных остатков в структуре белковой молекулы. К таким аминокислотным остаткам следует отнести 5Н-группы цистеина ОН-группы серина — МН-группы кольца имидазола в гистидине, а также некоторое значение придается карбоксильным группам аспарагиновой и глутаминовой аминокислот, индольной группе триптофана и др. Хотя вопрос о природе и механизме действия активных центров представляет большой интерес, но, к сожалению, наши сведения об этом являются пока ограниченными. Выяснено, что количество активных центров в ферментах, как правило, очень ограничено так, например, большинство ферментов имеют от 1 (трипсин, химотрипсин, карбокси-полипептидаза и др.) до 3—4 (уреаза) активных центров, и только отдельные ферменты содержат их в больших количествах (от 20 до 100 содержится в холинэстеразе и др.). 

[c.106]

    Трипсин и химотрипсин, очевидно, имеют второй активный центр, содержап ий гистидин. Второй участок удален от первого, но на спиральной цепочке они сближены. Установление активной роли гистидина основывалось частично на изменении скорости ферментативной реакции в зависимости от pH, что соответствовало предположению о стратегическом расположении слабоосновного остатка, имеющего характер гистидина. Даже сам имидазол также катализирует гидролиз простейших сложных эфиров (БрюИ С» и Шм Ир 1965—.19i57 Бендер, 1957). 7 о, что фермент в 10 раз эффективнее, чем имидазол, имеет аналогию в модельных опытах по мутаротации глюкозы — реакции, катализируемой кислотами и основаниями. о -Оксипиридин, содержащий кислотный и основной центры (оба относительно слабые), более эффективен как катализатор, чем смесь пиридина и фенола (Свайн, 1952). И в а-окси-пиридине, и в протеолитическнх ферментах бифункциональность повышает каталитическую активность, поскольку протоны могут быть одновременно поданы и отщеплены в сопряженной реакции. Механизм действия, предложенный, Нейратом (1957) для химотрипсина, сводится к следующему. При взаимодействии гидроксильной группы серина с имидазольным кольцом гистидина отщепляется протон и образуется активированный комплекс П, имеющий электрофильный и нуклеофильный центры. [c.714]

    Разработанные в последние годы методы селективного гидролиза, разделения и идентификации открыли новые возможности для химического изучения структуры полипептидов и белков. Как уже указывалось, эти природные продукты включают разнообразный материал антибиотики, гормоны, токсины, ферйенты,. вирусы, волокна и т. д. Хотя за короткий период времени был достигнут большой прогресс в выяснении структуры различных природных продуктов, работа по установлению химической структуры белков в значительной степени осложнена их макромолеку-лярной природой. Изучение последовательности аминокислот в полипептидах и белках показывает наличие в них своеобразных группировок аминокислот. Например, из семи основных аминокислот, имеющихся в АКТГ, четыре расположены по соседству, а все семь включены в последовательность из 14 аминокислот из семи кислых аминокислот, ирисутствуюпщх в этом гормоне, три находятся по соседству друг с другом. В рибонуклеазе три остатка серина и три остатка аланина находятся рядом аналогична располагаются три ароматические аминокислоты в инсулине. Для ряда ферментов — тромбина, трипсина, химотрипсина и фосфоглюкомутазы было отмечено наличие одинаковой последовательности из шести аминокислот. Отмечено, что в структуре-и механизме действия протеолитических ферментов важную роль играют определенные трипептиды [160]. В настоящее время из-за ограниченности наших знаний относительно точного молекулярного механизма действия гормонов и ферментов можно делать только предположения о значении тёх или иных аминокислотных группировок. Вопрос о связи определенной последовательности аминокислот с функциями различных соединений может быть выяснен лишь по мере накопления экспериментального материала. Тем самым, по-видимому, станет возможным значительно более полное понимание механизма действия природных соединений на молекулярном уровне. [c.418]

    К числу ферментов с хорошо изученной пространственной структурой относится протеолитический фермент а-химотрипсин, механизм действия которого подробно изучен и рассматривается в гл. V. а-Хи-мотрипсин образуется из каталитически неактивного химотрипсино-гена А, представляющего собой единую полипептидную цепь из 245 аминокислотных остатков, последовательность расположения которых установлена в работах [35, 36]. Пространственное строение химотрип-синогена А поддерживается пятью S—S-связями. а-Химотрипсин содержит 241 аминокислотный остаток и возникает в результате отщепления (трипсином) двух дипептидов, как это показано на рис. 33. Благодаря этому надрывается единая цепь, разделенная на три участка А, В VI С, удерживаемых теми же дисульфидными и внутримолекулярными нековалентными связями. Пространственное строение зимогена и фермента отличаются очень незначительно, но активный центр формируется только после отрыва дипептида. Необходимое изменение конформации происходит при взаимодействии карбоксильной группы Asp 194 с вновь возникшей концевой МНг-группой Leu 16. Эта ионная пара затем входит в глубь молекулы, что схематически показано на рис. 34.  [c.118]

    A. Ахунову и Д. H. Сахибову (1963, 1970) удалось получить гомогенную протекназу из яда гюрзы, причем, на последней стадии очистки (сефадекс Г-75 и ДЕАЕ-целлвдлоза) фермент обладал активностью, в 18 раз превышающий активность протеиназ цельного яда. Молекулярный вес энзима при гель-фильтрации через сефадекс Г-100 35000—37000. Полученный фермент по своим свойствам близок к трипсину, причем подавление его активности ДФФ (5.10 Щ) указывает на важную роль серина в механизме действия энзима. [c.87]

    Современная, так называемая рациональная, химиотерапия (направленное применение лекарственных препаратов в медицине) должна основываться на точном знании механизма действия лекарственных средств на биосинтез ферментов, на активность уже синтезированных ферментов или на регуляцию их активности в организме. Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательно действующие ингибиторы. Так, ингибитор ряда протеиназ (трипсина, химотрипсина и калликреина) трасилол широко применяется для лечения острого панкреатита—болезни, при которой уровень трипсина и химотрипсина в крови резко возрастает. Знание избирательного ингибиторного действия некоторых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты может служить методологической основой для разработки эффективных методов синтеза химиотерапевтических препаратов. Этот путь открывает широкие возможности для направленного воздействия на синтез ферментов в организме и регуляции интенсивности метаболизма при патологии. [c.148]

    Кристалл-токсины слабо растворяются в воде. В щелочной среде (pH >11) происходит их гидролиз, связанный с разрушением сульф-гидрильных групп. При инкубации кристаллов в течение 2 часов при pH = 12,0, происходит разрыв 40% дисульфидных связей и растворение 83% белка. Механизм действия кристаллов заключается в превращении протоксина в токсин, наблюдающийся в кишечнике восприимчивого насекомого под действием протеаз, близких по специфичности трипсину и хемотрипсину. [c.393]

    По-видимому, механизм действия других сериновых пептидаз включает этот же тип реакций двойного замещения. Например, было показано, что гидролиз -гранс-циннамоилимидазола, катализируемый трипсином и а-химотрипсином, имеет ряд общих черт в отношении последовательности стадий каталитического процесса, рН-зависимости реакции деацилирования, а также спектрального и кинетического поведения промежуточно образующегося ацилфермента (табл. 2-3) [35]. [c.250]

    Общими для двух ферментов являются также следующие их характеристики 1) локализация 2) скорость синтеза 3) характер активности (оба фермента являются эндопептидазами). Что касается последнего пункта, то большая часть соображений, высказанных относительно механизма действия химотрипсина, приложима в равной мере и к трипсину. Главное различие между трипсином и химотрипсином касается их субстратной специфичности. [c.427]

    Все проферменты поджелудочной железы активируются по сходному механизму для превращения в активную форму необходимо расщепление пептидной связи, образованной остатком аргинина или лизина около начала пептидной цепи предшественника. Именно это расщепление и производится трипсином или иным протеолитическим ферментом, осуществляющим активацию. Механизм действия всех таких ферментов, по-видимому, одинаков в основе его лежит гидролиз точно определенной пептидной связи, производимый в соответствии со специфичностью гидролизирующего фермента, причем необходима специфичность именно такого типа, как та, которой обладает трипсин. В трипси-ногене быка, например, разрывается связь между 6- и 7-амино-кислотными остатками, в химотрипсиногене — при действии трипсина — между 15-м и 16-м. Активация трипсиногена сопровождается отщеплением от белка гексапептида при активировании же химотрипсиногена фрагмент не отщепляется, так как его первый остаток остается соединенным с основной частью молекулы дисульфидной связью. [c.94]

    Тщательное исследование рН-функций оказалось весьма ценным при изучении механизма действия гидролаз. Возможность изолировать индивидуальные кинетические стадии с помощью методов остановленного потока, стационарной кинетики и релаксационной техники позволила получить вполне четкие результаты. Наиболее определенные данные при использовании некоторых субстратов были получены для трипсина и химотрипсина [2,3]. Именно с помощью такого подхода впервые было уста-йовлено участие остатков гистидина в механизме действия химотрипсина на стадиях ацилирования и деацилирования. Некоторые данные стационарной кинетики привели к полезным выводам о механизме действия негидролитических ферментов. Можно думать, что этот метод анализа механизмов ферментативных реакций будет быстро развиваться. Группа Альберти [4] провела очень тщательное измерение величин р/С и энтальпии ионизации связывающих группировок фумаразы. Данные о [c.217]

    Аналогичные механизмы действия серин-гистидиновой пары предполагаются и в активных центрах других пептидаз, например трипсина (КФ 3.4.4.4), тромбина (КФ 3.4.4.13) и ряда других. Как и а-химотрипсин, они обладают пептидазной и эстеразной активностью, но выбор субстратов осуществляется адсорбционным центром другого строения, что и изменяет специфичность их действия. Тромбин осуществляет превращение фибриногена в фибрин с образованием промежуточного продукта НгМ-фебринопептидал-СО-тромбина, дальнейшее превращение которого осуществляется имидазолом активного центра по такому же механизму, как и для а-химотрипсина. Эстеразная активность тромбина наблюдается при гидролизе этилового эфира № -бeнзoил-L-apгининa [7]. [c.164]

    В клетках поджелудочной железы синтезируются проферменты следующих эндопептидаз трипсина, химотрипсина и эластазы. В настоящее время полностью раскрыт механизм активации трипсиногена (профермента) с переводом его в активную форму — трипсин. Механизм активации сходен с таковым у пепсина и представляет собой частичный протеолиз под действием энтеропептидазы от полипептидной цепи трипсиногена отрывается N-концевой гексапептид. В результате такого отрыва и сопутствующих конформационных изменений полипептидной цепи формируется активный центр трипсина (рис. 12.4,12.5). Селективность действия трип- [c.376]

    Основная функция всех гемоглобинов одинакова, поэтому их можно рассматривать как изобелки. Следовательно, удвоение генов и последующие независимые мутации копий — это один из механизмов образования изобелков, в том числе изоферментов. Дальнейшее накопление мутаций в родственных генах ведет к еще большей дивергенции (расхождению) свойств соответствующих белков. Например, семейство родственных белков составляет группа протеолитических ферментов, включающая трипсин, химотрипсин, эластазу, тромбин, плазмин их называют сериновыми протеазами, поскольку они содержат в активном центре остаток серина, непосредственно участвующий в катализе. Механизм действия этих ферментов сходен, однако они различаются по субстратной специфичности и роли, которую выполняют в организме, поэтому название изоферменты к ним уже вряд ли применимо. Существуют и другие семейства протеаз аспартатные, цистеиновые и металлопротеиназы (содержат в активном центре аспарагиновую кислоту, или цистеин, или ион цинка соответственно). Все семейства вместе образуют суперсемейство протеаз. Продолжающееся накопление мутаций в конечном счете приводит к тому, что гены, возникшие в результате удвоения их общего предшественника, утрачивают признаки родства, а кодируемые ими белки имеют совершенно различные первичную структуру и функцию. Этот путь и ведет к увеличению количества и разнообразия генов при филогенезе. Удвоение генов и их дивергенция путем независимых мутаций составляют механизм дихотомической эволюции генов и соответствующих белков. [c.163]

    Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

    Ферментативное действие химотрипсина, как и других панкреатических протеаз (трипсина, эластазы), соответствует механизму общего кислотноосновного катализа, в котором принимают участие в качестве системы переноса заряда остатки аминокислот №5 , Авр и 8ег . Передача электронной плотности от заряженной при pH 8 отрицательно карбоксильной группы аспарагиновой кислоты через имидазольное кольцо гистидина к кислороду боковой цепи серина обусловливает повышение его иуклеофиль-ности настолько, что может осуществляться нуклеофильное воздействие на карбонильный углеродный атом пептидной связи. На промежуточно образующемся О-ацильном производном серина перенос заряда, обрывается, ио на последующей стадии деацилирования снова немедленно восстанавливается. Гидролитическое расщепление пептидной связи может быть рассмотрено как перенос ацила, при котором осуществляется перемещение ациль-иого остатка с аминогруппы на молекулу воды (рис. 3-31). [c.408]

    Особое значение индуцированное соответствие имеет для целого ряда ферментов, переносящих ацильные или фосфорильные группы из одного нуклеофильного центра в другой. Ацилхимо-трипсины служат примером случая низкой специфичности в отнощении нуклеофила. Ацетил- [114] и фуроилхимотрипсин [62] легко реагируют, наравне с водой, со всеми типами спиртов, перенося ацильную группу на КОН с образованием сложного эфира. Неспецнфич еский ацильный перенос такого рода, очевидно, неприемлем в тех случаях, когда целью действия фермента является перенос ацильной группы на специфический рецептор, но, поскольку размер молекулы любого спирта превышает размер молекулы воды, полностью удалить последнюю из активного центра невозможно. В этой ситуации фермент должен выбрать между КОН и НОН путем гарантирования того, что НОН в реакцию не вступит, и индуцированное соответствие обеспечивает механизм специфичности этого типа. Ярким примером такой специфичности является перенос фосфорильной группы на глюкозу, катализируемый фосфоглюкомутазой и гексокиназой. [c.517]

    Проферменты. Протеолитические ферменты пищеварительного тракта, а также поджелудочной железы синтезируются в неактивной форме—в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к превращению проферментов в активные ферменты под влиянием специфических агентов или других ферментов—протеиназ. Так, трипсин в поджелудочной железе синтезируется в форме неактивного трипсиногена. Поступив в кишечник, он превращается в активный трипсин в результате аутокатализа или под действием других протеиназ (механизм активации подробно рассматривается в главе 12). Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин происходит аутокаталитически в результате специфического ограниченного протеолиза в присутствии соляной кислоты и также связано с отщеплением от профермента специфического ингибитора пептидной природы. Эти превращения зимогенов в активные ферменты связаны с конформационными изменениями молекулы фермента и формированием активного центра или его раскрытием (демаскирование). Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-пред-шественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образуются проферменты. Примерами подобного активирования белков является активиро- [c.153]

    В соответствии с механизмом гель-фильтрации при выборе марки (О-индекса) сефадекса следует руководствоваться предполагаемой величиной молекулярного веса пептидов. Если гидрОлизат содержит крупные пептиды, целесообразно использовать сефадекс 0-50 или 0-75. Если средняя величина молекулярного веса пептидов невелика, то предварительное фракционирование проводят на сефадексе 0-25. Чем выше специфичность расщепления (например, при действии трипсина на ацетил- и трифторацетилбелки или при расщеплении бромцианом), тем больше вероятность получения крупных пептидов. В этих случаях используется сефадекс с более высоким значением индекса О. При неспецифическом гидролизе (гидролиз химотрипсином, субтилизином, папаином, пепсином, кислотой и т. п.) обычно получаются мелкие пептиды, которые следует предварительно фракционировать на сефадексах с низким значением индекса О. [c.227]

---

75. Переваривание белков. Протеиназы — пепсин, трипсин, химотрипсин; проферменты протеиназ и механизмы их превращения в ферменты. Субстратная специфичность протеиназ. Экзопептидазы и эндопептидазы.

В пищевых продуктах содержание свободных аминокислот очень мало. Подавляющее их количество входит в состав белков, которые гидролизуются в ЖКТ под действием ферментов протеаз (пептидщцролаз). Субстратная специфичность этих ферментов заключается в том, что каждый из них с наибольшей скоростью расщепляет пептидные связи, образованные определёнными аминокислотами. Протеазы, гидролизующие пептидные связи внутри белковой молекулы, относят к группе эндопептидаз. Ферменты, относящиеся к группе экзопептидаз, гидролизуют пептидную связь, образованную концевыми аминокислотами. Под действием всех протеаз ЖКТ белки пищи распадаются на отдельные аминокислоты, которые затем поступают в клетки тканей.

Переваривание белков в желудке

Желудочный сок — продукт нескольких типов клеток. Обкладочные (париетальные) клетки стенок желудка образуют соляную кислоту, главные клетки секретируют пепсиноген. Добавочные и другие клетки эпителия желудка выделяют муцинсодержащую слизь. Париетальные клетки секретируют в полость желудка также гликопротеин, который называют «внутренним фактором» (фактором Касла). Этот белок связывает «внешний фактор» — витамин В₁₂, предотвращает его разрушение и способствует всасыванию.

Образование и роль соляной кислоты. Основная пищеварительная функция желудка заключается в том, что в нём начинается переваривание белка. Существенную роль в этом процессе играет соляная кислота. Белки, поступающие в желудок, стимулируют выделение гистамина и группы белковых гормонов —гастринов которые, в свою очередь, вызывают секрецию НСI и профермента — пепсиногена. Источником Н⁺ является Н₂СО₃, которая образуется в обкладочных клетках желудка из СО₂, диффундирующего из крови, и Н₂О под действием фермента карбоангидразы (карбонатдегидра-тазы):

Н₂О + СО₂ → Н₂СО₃ → НСО₃^— + H⁺

Диссоциация Н₂СО₃ приводит к образованию бикарбоната, который с участием специальных белков выделяется в плазму в обмен на С1^—, и ионов Н⁺, которые поступают в просвет желудка путём активного транспорта, катализируемого мембранной Н⁺/К⁺-АТФ-азой. При этом концентрация протонов в просвете желудка увеличивается в 10⁶ раз. Ионы Сl^— поступают в просвет желудка через хлоридный канал. Концентрация НСl в желудочном соке может достигать 0,16 М, за счёт чего значение рН снижается до 1,0-2,0. Приём белковой пищи часто сопровождается выделением щелочной мочи за счёт секреции большого количества бикарбоната в процессе образования НСl. Под действием НСl происходит денатурация белков пищи, не подвергшихся термической обработке, что увеличивает доступность пептидных связей для протеаз. НСl обладает бактерицидным действием и препятствует попаданию патогенных бактерий в кишечник. Кроме того, соляная кислота активирует пепсиноген и создаёт оптимум рН для действия пепсина.

Механизм активации пепсина. Под действием гастринов в главных клетках желудочных желёз стимулируются синтез и секреция пепсиногена — неактивной формы пепсина. Пепсиноген — белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 40 кД. Под действием НСl он превращается в активный пепсин (молекулярная масса 32,7 кД) с оптимумом рН 1,0-2,5. В процессе активации в результате частичного протеолиза от N-конца молекулы пепсиногена отщепляются 42 аминокислотных остатка, которые содержат почти все положительно заряженные аминокислоты, имеющиеся в пепсиногене. Таким образом, в активном пепсине преобладающими оказываются отрицательно заряженные аминокислоты, которые участвуют в конформационных перестройках молекулы и формировании активного центра. Образовавшиеся под действием НСl активные молекулы пепсина быстро активируют остальные молекулы пепсиногена (аутокатализ). Пепсин в первую очередь гидролизует пептидные связи в белках, образованные ароматическими аминокислотами (фенилаланин, триптофан, тирозин) и несколько медленнее — образованные лейцином и дикарбоновыми аминокислотами. Пепсин — эндопептидаза, поэтому в результате его действия в желудке образуются более короткие пептиды, но не свободные аминокислоты.

Переваривание белков в кишечнике.

Желудочное содержимое (химус) в процессе переваривания поступает в двенадцатиперстную кишку. Низкое значение рН химуса вызывает в кишечнике выделение белкового гормона секретина, поступающего в кровь. Этот гормон в свою очередь стимулирует выделение из поджелудочной железы в тонкий кишечник панкреатического сока, содержащего НСО₃^—, что приводит к нейтрализации НСl желудочного сока и ингибированию пепсина. В результате рН резко возрастает от 1,5-2,0 до ∼7,0. Поступление пептидов в тонкий кишечник вызывает секрецию другого белкового гормона — холецистокинина, который стимулирует выделение панкреатических ферментов с оптимумом рН 7,5-8,0. Под действием ферментов поджелудочной железы и клеток кишечника завершается переваривание белков.

Активация панкреатических ферментов В поджелудочной железе синтезируются проферменты ряда протеаз: трипсиноген, химотрипсиноген, проэластаза, прокарбоксипептидазы А и В. В кишечнике они путём частичного протеолиза превращаются в активные ферменты трипсин, химотрипсин, эластазу и карбоксипептидазы А и В.

Активация трипсиногена происходит под действием фермента эпителия кишечника энтеропептидазы. Этот фермент отщепляет с N-конца молекулы трипсиногена гексапептид Вал-(Асп)₄-Лиз. Изменение конформации оставшейся части полипептидной цепи приводит к формированию активного центра, и образуется активный трипсин. Последовательность Вал-(Асп)₄-Лиз присуща большинству известных трипсиноге-нов разных организмов — от рыб до человека.

Образовавшийся трипсин активирует химотрипсиноген, из которого получается несколько активных ферментов (рис. 9-3). Химотрипсиноген состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 245 аминокислотных остатков и пяти дисульфидных мостиков. Под действием трипсина расщепляется пептидная связь между 15-й и 16-й аминокислотами, в результате чего образуется активный π-химотрипсин. Затем под действием π-химотрипсина отщепляется дипептид сер(14)-арг(15), что приводит к образованию δ-химотрипсина. Отщепление дипептида тре(147)-арг(148) завершает образование стабильной формы активного фермента — α-химотрипсина, который состоит из трёх полипептидных цепей, соединённых дисульфидными мостиками. Остальные проферменты панкреатических протеаз (проэластаза и прокарбоксипептидазы А и В) также активируются трипсином путём частичного протеолиза. В результате образуются активные ферменты — эластаза и карбокси-пептидазы А и В.

Специфичность действия протеаз. Трипсин преимущественно гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами аргинина и лизина. Химотрипсины наиболее активны в отношении пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических аминокислот (Фен, Тир, Три). Карбоксипептидазы А и В — цинксодержащие ферменты, отщепляют С-концевые остатки аминокислот. Причём карбоксипептидаза А отщепляет преимущественно аминокислоты, содержащие ароматические или гидрофобные радикалы, а карбоксипептидаза В — остатки аргинина и лизина. Последний этап переваривания — гидролиз небольших пептидов, происходит под действием ферментов аминопептидаз и дипептидаз, которые синтезируются клетками тонкого кишечника в активной форме.

• Аминопептидазы последовательно отщепляют N-концевые аминокислоты пептидной цепи. Наиболее известна лейцинаминопептидаза — Zn²⁺— или Мn²⁺-содержащий фермент, несмотря на название, обладающий широкой специфичностью по отношению к N-концевым аминокислотам.

• Дипептидазы расщепляют дипептиды на аминокислоты, но не действуют на трипептиды.

В результате последовательного действия всех пищеварительных протеаз большинство пищевых белков расщепляется до свободных аминокислот.

Экзопептидазы(экзопротеиназы) —ферменты, гидролизующие белки, отщепляяаминокислотыот концапептида:карбоксипептидазы— от C-конца,аминопептидазы— от N-конца,дипептидазырасщепляют дипептиды. Экзопептидазы синтезируются в клеткахтонкого кишечника(аминопептидазы, дипептидазы) и вподжелудочной железе(карбоксипептидаза). Функционируют эти ферменты внутриклеточно в кишечномэпителиии, в небольшом количестве, в просветекишечника.

Эндопептидазы(эндопротеиназы) —протеолитические ферменты(пепсин,трипсин,химотрипсин), расщепляющиепептидные связивнутрипептидной цепи. С наибольшей скоростью ими гидролизуются связи, образованные определённымиаминокислотами. Эндопептидазы синтезируются в видепроферментов, активируемых затем при помощи избирательногопротеолиза. Таким образом клетки, секретирующие эти ферменты защищают собственные белки от разрушения. От действия ферментовклеточную мембрануклеток животных защищает также поверхностный слойолигосахаридов—гликокаликс, а вкишечникеижелудке— слой слизи.

КРОК 1 Фармация

%PDF-1.7 % 2 0 obj > endobj 4 0 obj > stream

Елена

КРОК 1 Фармация

application/pdf2013-09-27T23:24:51+02:00Kingsoft Office2020-01-10T21:46:49+02:00uuid:a502b765-5200-41ce-9aa6-a102a565eccbuuid:75e67a67-f06c-4850-9c44-444a90eb93b2 endstream endobj 32 0 obj > stream x= 0} 4QDԃw)_6aZVEB#d\cfC.F}R

4&aO

Большая Энциклопедия Нефти и Газа, статья, страница 3

Химотрипсиноген

Cтраница 3

В поджелудочной железе синтезируется ряд химотрип-синов ( а -, 3 — и л-химотрипсины) из двух предшественников-химотрипсиногена А и химотрипсиногена В. Активируются проферменты в кишечнике под действием активного трипсина и химотрипсина. Полностью раскрыта последовательность аминокислот химотрипсиногена А, во многом сходная с последовательностью аминокислот трипсина. Он состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 246 аминокислотных остатков. Получены доказательства, что разрыв одной пептидной связи между аргинином и изолейцином в молекуле химотрипсиногена А под действием трипсина приводит к формированию л-химотрипсина, обладающего наибольшей ферментативной активностью. Последующее отщепление дипеп-тида Сер-Apr приводит к образованию б-химотрипсина. Аутокаталити-ческий процесс активирования, вызванный химотрипсином, сначала способствует формированию неактивного промежуточного неохимотрипсина, который под действием активного трипсина превращается в а-химотрип-син; этот же продукт образуется из б-химотрипсина, но под действием активного химотрипсина.  [32]

Химотрипсин — это протеолитический фермент, секретируемый из поджелудочной железы в тонкий кишечник в виде неактивного предшественника, или зимогена, называемого химотрипсиногеном. Химо-трипсиноген, представляющий собой полипептидную цепь из 245 аминокислотных остатков и содержащий пять дисульфидных связей, образованных пятью остатками цистина, активируется в тонком кишечнике под действием другого протеолитического фермента-трипсина.  [33]

Пепсин, трипсин в химотрипсин вырабатываются железистыми клетками в виде неактивных преферментов — препепсина, претрипсина и прехимотрипсина ( пепсиноге-на, трипсиногена, химотрипсиногена соответственно старой номенклатуре), так как их активные центры блокированы дополнительными пептидами, после гидролитического отщепления которых фермент приобретает активность.  [34]

Хроматографический метод очистки и фракционирования белков на карбоксильной смоле Амберлит IRC-50 успешно применен к следующим белкам: цитохрому С, рибонуклеазе, лизоциму, химотрипсиногену, химотрипсину, гиалуронидазе, гемоглобинам, адренокортикотропному гормону, инсулину и др. Среди этих работ следует отметить обнаружение двух хроматографически активных белков, обладающих активностью рибонуклеазы, доказательство распада индивидуального лиофилизованного лизоцима при комнатной температуре и лиофилизованной рибонуклеазы при 0 С. Наибольшее значение тонкая хроматографическая очистка белка имеет при изучении первичной его структуры и физико-химических констант, характеризующих вторичную и третичную структуры.  [35]

Образование из неактивных белков-предшественников установлено для целого ряда ферментов: пепсина, реннина, трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы А; их получали, соответственно, из пепсиногена, прореннина, трипсиногена, химотрипсиногена, прокарбоксипептидазы А. Активация предшественника характерна также для многих белков, участвующих в системе свертывания крови: так, протромбин превращается в тромбин, плазминоген — в плазмин, а фибриноген — в фибрин. Имеются сведения о существовании в поджелудочной железе проэстеразы.  [36]

Расшифрованы первичные структуры миоглобина человека ( 153 аминокислотных остатка), а-цепи ( 141) и 3-цепи ( 146) гемоглобина человека, цитохрома С из сердечной мышцы человека ( 104), лизоцима молока человека ( 130), химотрипсиногена быка ( 245) и многих других белков, в том числе ферментов и токсинов. На рис. 1.14 представлена последовательность аминокислотных остатков проинсулина. Видно, что молекула инсулина ( выделена темными кружками), состоящая из двух цепей ( А-21 и В — 30 аминокислотных остатков), образуется из своего предшественника — проинсулина ( 84 аминокислотных остатка), представленного одной полипептидной цепью, после отщепления от него пептида, состоящего из 33 аминокислотных остатков.  [38]

Следует упомянуть также, хотя это и выходит за рамки нашего обсуждения, что Сайке [107] использовал измерения времен спин-решеточной и спин-спиновой релаксации 19F для определения скорости обмена между трифторацетил — /) — фенилаланином и его комплексами с а-химотрипсином, фосфорилированным химотрип-сином и химотрипсиногеном.  [39]

Таким образом, протеолитические ферменты сока поджелудочной железы сами по себе не активны до тех пор, пока не достигнут тонких кишок и не придут в соприкосновение с энтерокиназой, которая переводит трипсиноген в трипсин; а уже последний в дальнейшем начинает активировать и трипсиноген, и химотрипсиноген. Впоследствии оказалось, что и энтерокиназа выделяется в неактивном состоянии и нуждается в активизации.  [40]

Известны предшественники для ряда гормонов ( напр дчя гастрина, глюкагона и инсулина), к-рые переходят в актив-н ю форму посредством расщепления полипептидной цепи в участках, содержащих два последовательно расположенных остатка основных аминокислот ( аргинин и лизин) Расщеп-тение осуществчяется с участием специфич зндопептидазы, делствующей в ансамбле со вторым ферментом, имеющим карбоксипептидазную активность Последний удаляет остат-кч концевых основных аминокислот, завершая превращ пептида в активный гормон К белкам, подвергающимся протеолитич активации, относятся также протеиназы ( пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины, проколлаген, белки системы свертывания крови и др В нек-рых случаях неактивные формы ферментов ( зимогены) необходимы для временной консервации ферментов Так, зимогены трипсина и химотрипсина ( соотв трипсиноген и химотрипсиноген) синтезируются в подже.  [41]

Установлено, что различные белки неодинаково реагируют с сульфитом, и условия, необходимые для полного превращения белка в S-сульфопротеин, несколько различны от случая к случаю. Реакция с химотрипсиногеном протекает очень быстро на воздухе при 38 без добавления дополнительного окислителя. Наряду с этим, чтобы довести до конца превращение рибонуклеазы в S-сульфопротеин, необходимо присутствие окислителя и концентрированного раствора мочевины. Скорости реакции сульфита и тетратионата с SS — и соответственно SH-группами большинства пептидов и некоторых белков значительно выше, чем скорость, с которой протекает реакция взаимодействия между этими двумя соединениями. Рекомендуется следить при помощи амперометриче-ского титрования за ходом процессов восстановления и окисления каждого индивидуального белка. Образование SH-групп при действии сульфита на цистин и окисленный глутатион, а также на рибонуклеазу и химотрип-синоген показано на фиг.  [42]

Второй фермент из группы панкреатических прогсаз — — химотрипсин — также синтезируется в неактивной форме в виде химотрипсиногена, который активируется трипсином. Существует несколько форм химотрипсиногена и химотрипсина. Трипсин и химотрипсин ( а также панкреатопептидаза, или эластаза) расщепляют преимущественно внутренние пептидные связи белков. Действуют эти ферменты и на высокомолекулярные полипептидът: — В результате образуются низкомолекулярные пептиды и аминокислоты. При совместном действии на белки трипсина и химотрипсина образуется больше продуктов гидролиза, чем их сумма при раздельном действии на белки этих ферментов. В составе панкреатического сока выделяется некоторое количество ингибитора трипсина.  [43]

Клетками панкреатической железы образуется неактивный химотрипсиноген, который превращается в химотрипсин при действии трипсина. Химотрипсин, подобно трипсину, ускоряет при рН — 7 6 гидролиз белков, альбумоз и пептонов, а также и протаминов.  [44]

В химотрипсиногене эта водородная связь отсутствует. Действительно, уточнение структур химотрипсиногена и а-химотрипсина с помощью рентгеноструктурного анализа показывает различия в расположении каталитической триады в зимогене и ферменте. Это конформационное изменение в общей трехмерной структуре фермента, возможно, вызывает значительные изменения химических свойств каталитического центра, что может играть важную роль в увеличении ферментативной активности при активации зимогена.  [45]

Страницы:      1    2    3    4

000323

3

Раздел 1. Биохимия системы органов пищеварения

Блок 1. Переваривание простых белков

в желудочно-кишечном тракте

1. В ГЛАВНЫХ КЛЕТКАХ ЖЕЛУДКА СИНТЕЗИРУЕТСЯ

1) соляная кислота

3) пепсиноген

2) трипсиноген

4) проэластаза

2. В ОБКЛАДОЧНЫХ КЛЕТКАХ ЖЕЛУДКА ОБРАЗУЕТСЯ

1) соляная кислота

3) пепсиноген

2) химотрипсиноген

4) прокарбоксипептидаза

3. ПЕПСИН ВЫРАБАТЫВАЕТСЯ В

1) главных клетках желудка в виде активного пепсина

2) добавочных клетках желудка в виде пепсиногена

3) главных клетках желудка в виде пепсиногена

4) обкладочных клетках желудка в виде активного пепсина

4. ФЕРМЕНТ, ГИДРОЛИЗУЮЩИЙ БЕЛКИ В ЖЕЛУДКЕ

1) коллагеназа

3) гастриксин

2) трипсин

4) аминопептидаза

5. ФЕРМЕНТ, ГИДРОЛИЗУЮЩИЙ БЕЛКИ В ЖЕЛУДКЕ

1) карбоксипептидаза

3) дипептидаза

2) химотрипсин

4) пепсин

6. ФЕРМЕНТ ПЕРЕВАРИВАНИЯ БЕЛКОВ В ЖЕЛУДКЕ У ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ

1) аминопептидаза

3) пепсин

2) трипсин

4) реннин

7. ФЕРМЕНТ ПЕРЕВАРИВАНИЯ БЕЛКОВ В ТОНКОМ КИШЕЧНИКЕ

1) химотрипсин

3) пепсин

2) реннин

4) гастриксин

8. ФЕРМЕНТ, ГИДРОЛИЗУЮЩИЙ БЕЛКИ В КИШЕЧНИКЕ

1) трипсин

3) пепсин

2) гастриксин

4) реннин

9. ФЕРМЕНТ, ГИДРОЛИЗУЮЩИЙ БЕЛКИ В КИШЕЧНИКЕ

1) аминопептидаза

3) липаза

2) гастриксин

4) пепсин

Analysis of the degree of structural and functional uniformity polyvalent protease inhibitor contained in the pancreas of animals, and soybean trypsin inhibitor

11

(Кирпиченок, Гидранович, Шиленок, 2000; Вовчук и соавт., 2001; Bashir,

Pagano, 2003; Doherty, Dawson, Mayer, 2003; He, Chen, Zheng, 2004; Lancaster et

al., 2005; Wiedow, Meyer-Hoffert, 2005; Akbasheva, 2007; Santos, Moreira, 2007;

Al-Majid, Waters, 2008; Nichols, Lagana, Parwani, 2008; Søreide, 2008; Tanaka,

2008). Чрезмерной активации протеолиза способствуют также окислительное

воздействие и микробные инфекции (Ефременко, Конторщикова, 2003;

Rementeria et al., 2005).

Протеолиз можно считать одним из механизмов биологической

регуляции гомеостаза. Роль ферментов-протеаз здесь заключается в

осуществлении гидролиза двух типов: полного и ограниченного. Путем

полного протеолиза происходит деградация и расщепление белков.

Разрушению подвергаются ауто- и гетерофагоцитированные, дефектные,

поврежденные, мутантные белки (Steinbuch, 1984; Glaumann et al., 1986;

Ротанова, 2001). Множественность субстратов белковой природы требует

большого количества протеиназ. Для завершения полного гидролиза коротких

пептидов – конечную стадию протеолиза – необходимы карбокси- и

аминопептидазы, ди- и трипептидазы, всего около трех десятков пептидаз

различной специфичности (Степанов, 1998). Несмотря на огромный ряд

протеолитических ферментов организма, лишь некоторые протеолитические

системы содействуют полному гидролизу белков до аминокислот (Kadowaki,

Kanazawa, 2003). Ограниченный протеолиз активируя, инактивируя,

модифицируя гормоны, ферменты, биологически активные пептиды, а также

поддерживая их необходимый уровень, обеспечивает эндоцитоз, деление

клетки, синтез белков, изменение формы клетки, перемещение клеточных

органелл, деградацию рецепторов и факторов роста (Мосолов, 1971; Pontremoli,

Melloni, 1986; Ротанова, 2001). Доказано участие экзогенных и эндогенных

протеаз в формировании иммунного ответа (Веремеенко, Голобородько, 1986;

Маянский, Цырендоржиев, Рупакова, 1987). Клеточные протеазы оказывают

влияние на гуморальный ответ (Redini et al., 1998). Реакции ограниченного

протеолиза также лежат в основе функционирования таких важнейших

Активность протеолитических ферментов, ингибиторов трипсина и химотрипсина в высших грибах Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

577.15.156.001.4

АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА И ХИМОТРИПСИНА В ВЫСШИХ ГРИБАХ

Л.А. ГЗОГЯН, М.Т. ПРОСКУРЯКОВ

Кубанский государственный университет

Дефицит животного сырья и несовершенство микробных препаратов стимулировали интерес к базиди-альным грибам как возможным продуцентам протео-литических ферментов [1]. Два обстоятельства оправ -дывают поиск ферментов пищевого назначения среди высших базидиомицетов: наличие среди них большого числа съедобных грибов и отсутствие спороношения в культуре, что уменьшает опасность профессиональных заболеваний в условиях производства [2]. Протео-литические ферменты широко применяются в пищевой промышленности. С увеличением выработки сыров возрос интерес к замене животного химозина ферментами другого происхождения. В результате исследований 44 штаммов базидиомицетов, способных синтезировать молокоствораживающие ферменты, установлено, что два вида базидиомицетов — Irpexlacteus и Fomitopsis pinícola образуют протеазы, являющиеся хорошими заменителями химозина [3].

Был проведен скрининг 400 естественных видов высших грибов с целью установления у них протеоли-тической активности [4]. Около 1/3 исследованных видов агариковых и болетовых грибов содержали про-теиназы, разжижающие фибрин и казеин.

Впервые ингибиторы трипсиноподобных ферментов в высших грибах обнаружены в 1985 г. в видах Armillaria mellea, Nematoda fasciculare и Tricholoma populinum [5]. Проведенный скрининг 46 видов 10 семейств базидиомицетов выявил высокую активность ингибитора трипсина в 8 видах 5 семейств [6]. В 2000 г. были получены данные о наличии ингибитора трипсина в 54 изученных видах порядка Agaricales и Aphyllophorales [7].

Цель нашей работы — детальное исследование про-теолитической активности к природным и синтетическим субстратам, а также активности ингибитора трипсина и химотрипсина в базидиомицетах, наиболее распространенных в Краснодарском крае.

Исследовано 18 видов грибов порядков Boletales, Agaricales, Aphyllophorales, Russulales, относящихся к различным эколого-трофическим группам. Для экспериментов использовали сок плодовых тел базидиоми-цетов, полученный после измельчения, замораживания, размораживания и фильтрации. Сок хранили в замороженном виде при температуре -18° С.

Содержание растворимого белка определяли согласно [8], общего белка — по Кьельдалю [9], химазную (молокосвертывающую) активность, выраженную в единицах, — по [10]. Протеолитическую активность щелочных протеаз определяли по казеину методом [11], кислых протеаз — с использованием денатурированного гемоглобина методом [12]. Активность выра-

жали в единицах оптической плотности Е280. Трипсиноподобную, химотрипсиноподобную и эластолитиче-скую активности определяли по синтетическим субстратам М-бензоил-Д£-я-нитроанилида (БАПНА), М-сукцинил^-фенилаланин-п-нитроанилида (СФПНА)

[13], N-сукцинил-триаланин-п-нитроанилида (СТАПНА)

[14]. Активность выражали в микромолях расщепленного субстрата в минуту.

Активность ингибитора трипсина и химотрипсина определяли соответствующими методами [15, 16].

При определении оптимумов pH активности ферментов использовали растворы субстрата и образца, приготовленные на универсальной буферной смеси [17].

Содержание белка в исследованных грибах (табл. 1) не имело закономерного характера распределения по таксономическим группам и составляло от

1.3 до 7,2 мг/мл. Максимальное количество обнаружено в Suillusflavidus из порядка Boletales, минимальное

— в Pleurotus ostreatus из порядка Agaricales. Близкие по содержанию белка виды порядка Russulales: 1,5—2,2 мг/мл. Содержание общего белка, по нашим данным, составляет, г/100 г продукта: шампиньон 4,3; подосиновик 3,3; лисички 1,6; масленок 2,0; березовик 5,0; белый гриб 5,5; опенок 3,3. Исходя из этого, было рассчитано процентное содержание растворимого белка от общего, составившее от 2,8 до 10%.

Во всех видах обнаружена активность протеиназ к использованным специфичным синтетическим и природным субстратам (табл. 1). Использование синтетических субстратов позволило отнести определяемую активность к группе трипсиноподобных, химотрипси-ноподобных или эластолитических ферментов.

Активность трипсиноподобных ферментов колебалось в диапозоне от 0,3 до 2,2 мкМ. Наиболее высокой она была в порядке Boletales, где максимальная активность у видов Boletus edulis — 2,2 мкМ, минимальная — в Cantarellus aurantiaca — 1,4 мкМ. В порядке Agaricales наибольшая трипсиноподобная активность у вида Flammulina velutipes семейства Tricholomataceae —

1.3 мкМ, наименьшая — у вида Pleurotus cornucopiae семейства Pleurotaceae — 0,3 мкМ. В порядке Russulales наибольшее количество трипсиноподобных ферментов наблюдалось у вида Lactarius pubescens — 1,6 мкМ, а в порядке Aphyllophorales у вида Herricium erinaceus

— 0,9 мкМ.

Активность химотрипсиноподобных ферментов колебалась от 1,3 до 4,8 мкМ. Наиболее высокой она была в порядке Boletales, вид Boletus edulis. В порядке Agaricales высокой активностью отличался вид Flammulina velutipes — 2,4 мкМ, в порядке Russulales — Lacatarius piperatus — 2,7 мкМ. Наименьшей активностью обладали грибы порядка Aphyllophorales, вид Hericium erinaceus — 2,1 мкМ.

Таблица 1

Белок, мг/мл Активность по субстратам

Порядок, вид БАПНА, мкМ СФПНА, мкМ СИАПНА Молоко Казеин Оптимум pH Г емогло -бин, pH Оптимум pH

Boletales:

Boletus edulis 2,4 2,2 4,8 0,24

Leccinum auranticum 5,2 1,8 3,8 0,11

Leccinum melanum 5,6 1,5 2,4 0,14

Boletus castanus 3,5 2,1 1,9 0,12

Suillus flavidus 7,2 1,9 2,3 0,8

Cantarellus aurantiaca 1,9 1,4 2,4 0,09

Agaricales: Flammulina velutipes 4,1 1,3 2,4 0

Armmilaria mellea 1,9 1,1 2,3 0

Macrolepiota procera 4,5 1,2 1,9 0

Agaricus silvaficus 1,8 0,8 2,2 0

Amanita phaloides 3,6 0,4 1,9 0

Pleurotus ostreatus 1,3 0,2 2,2 0

Pleurotus cornucopiae 1,5 0,3 1,4 0

Russulales: Lactarius pubescens 2,2 1,6 2,7 0

Russula veska 1,9 1,2 2,5 0

Lactarius piperatus 1,54 0,9 2,9 0

Aphylloph orales: Coriolus versicolor 3,2 1,3 1,3 0

Hericium erinaceus 4,2 2,1 2,1 0

Между содержанием трипсиноподобных и химот-рипсиноподобных ферментов существует положительная корреляционная зависимость r 0,64.

Эластолитическая активность обнаружена только у видов порядка Boletales, где максимальной активностью обладал вид Boletus edulis — 0,24 мкМ, минимальной — Cantarellus aurantiaca — 0,09 мкМ.

Активность по молоку была в диапазоне 0,2—4,9 ед. Самая высокая молокосвертывающая активность наблюдалась у видов порядка Boletales: максимальная -у Boletus edulis — 4,9 ед., минимальная — у Leccinum melanum — 1,7 ед. В порядкеAgaricales этот показатель наиболее выражен у вида Flammulina velutipes — 1,7 ед., наименее — у Pleurotus ostreatus — 0,2 ед. В порядках Aphyllophorales и Russulales высокая активность была у видов Lactariuspubecens и Hericium erinaceus — 1,4 и 1,2 ед. соответственно.

Высокая активность щелочных протеаз отмечена у видов порядка Boletales: наибольшая в виде Boletus edulis — 0,78 ед., наименьшая — в Cantarellus aurantiaca

— 0,33 ед. Далее следуют виды в порядках Agaricales, Russulales. Наименее выражена активность щелочных протеаз в видах порядка Aphyllophorales. В порядке

4,9 0,78 8,5 0,26 3,5

2,8 0,64 8,5 0,41 2,5

1,7 0,57 8,5 0,38 2,5

3,4 0,67 9,5 0,33 3,0

2,2 0,73 8,5 0,22 2,0

2,2 0,33 8,0 0,35 3,5

1,7 0,76 8,5 0,22 3,5

1,2 0,38 8,5 0,11 5,0

0,6 0,45 8,0 0,24 3,5

0,8 0,53 9,5 0,25 3,0

0,4 0,28 8,5 0,12 3,5

0,2 0,14 9,0 0,38 3,0

0,3 0,28 9,5 0,12 3,0

1,4 0,23 8,0 0,13 2,5

1,2 0,26 8,0 0,17 2,5

2,4 0,33 8,5 0,19 2,5

0,8 0,18 8,5 0,12 3,0

1,2 0,26 9,0 0,16 2,5

Agaricales наибольшая активность по казеину у Пашшиііпа уеШіреі’ — 0,76 ед., наименьшая — у Ріеигоїш віїгеаїш’ — 0,14 ед. В порядках Кшзиіаіез и Аркуііоркогаіеі’ высокой активностью по казеину обладали виды Ьасїагіиі’ риЬеі’сет — 1,4 ед. и Негісіиш егіпасеш — 0,26 ед. Оптимум активности этих протеаз был в интервале pH от 7,5 до 9,5.

Активность кислых протеиназ обнаружена во всех видах. В порядке Боіеїаіеі’ она наиболее выражена у вида Ьессіпиш аигапґісиш — 0,41ед., наименее — у вида 8иіііш’ Jlavidus — 0,22 ед. В порядке Agaricales высокая активность наблюдалась у Ріеигои оіігеаи -0,38 ед., низкая у Агшшііагіа шеііеа — 0,11 ед. Виды порядков Аркуііоркогаіеі’ и Кшзиіаіез схожи по активности расщепления гемоглобина, составляющей от 0,12 до 0,19 ед. Оптимум активности кислых протеаз находился при pH 2,5-3,5.

Установлена положительная корреляционная зависимость между молокосвертывающей активностью и активностями щелочных и кислых протеаз: г 0,68 и 0,36 соответственно, между активностями щелочных и кислых протеаз: г 0,37, между содержанием белка и активностью ферментов: г 0,64.

Таблица 2

Порядок, вид Ингибитор, мг/г

трипс ина химотрипсина

Boletales:

Boletus edulis 3,7 5,б

Leccinum aurantiacum 1,7 0

Leccinum melanum 5,3 5,9

Boletus castanus 1,8 0

Suillus flavidus 2,3 4,2

Cantarellus aurantiaca 3,б 0

Agaricales:

Flammulina velutipes 2,0 0

Armillaria mellea 2,0 7,8

Macrolepiota procera 1,1 0

Agaricus silvaficus 1,0 7,4

Amanita phaloides 1,2 0

Pleurotus ostreatus 1,9 0

Pleurotus cornucopiae 0,б 0

Russulales:

Lactarius pubescens 0,4 0

Rusula veska 0,3 0

Lactarius piperatus 1,1 0

Aphyllophorales:

Coriolus versicolor 0,2 7,2

Herricium erinaceus 0,4 0

Ингибиторы трипсина обнаружены во всех исследованных видах базидиомицетов (табл. 2). Внутри порядка Boletales максимальной активностью ингибитора трипсина обладал вид Leccinum melanum — 5,3 мг/г, минимальной — вид Leccinum auranticum — 1,7 мг/г. В порядке Agaricales этот показатель высок у видов Flammulina velutipes и Armmilaria mellea — 2,0 мг/г. В порядке Russulales высокая активность ингибитора трипсина наблюдалась у вида Lactarius piperatus -1,1 мг/г, в порядке Aphyllophorales — у вида Herricium erinaceus — 0,4 мг/г. Mежду содержанием ингибитора трипсина и количеством растворимого белка установлена положительная корреляционная зависимость: r 0,78.

Ингибитор химотрипсина обнаружен в б видах ба-зидиомицетов: Leccinu melanum, Boletus edulis,

Armillaria mellea, Agaricus slvaficus, Coriolus versicolor (табл. 2). Mаксимальной активностью обладал вид Armillaria mellea — 7,8, минимальной — вид Suillus flavidus — 4,2 мг/г.

Таким образом, во всех исследованных видах грибов обнаружена протеолитическая активность к природным и синтетическим субстратам. Анализ характера распределения протеолитической активности по таксономическим группам свидетельствует, что наиболее активными к природным и синтетическим субстратам были виды порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russulales и Aphyllophorales. Наиболее перспективными видами для поисков заменителя химозина являются Boletus edulis, Boletus castanus, Leccinum

auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales. Эластолитиче-ская активность обнаружена только у видов порядка Boletales. Установлена положительная корреляционная зависимость между трипсиноподобными, химот-рипсиноподобными и эластазоподобными ферментами. Активность ингибитора трипсина обнаружена во всех видах, а ингибитора химотрипсина в 6 из 18 исследованных видов. На основании полученных данных можно предположить, что базидиомицеты могут служить сырьем для получения протеолитических ферментов и их ингибиторов, используемых в пищевой технологии и медицине.

ЛИТЕРАТУРА

1. Белова Н.В. Базидиомицеты — источники биологически активных веществ // Раст. ресурсы. — 1991. — № 2. — С. 23-27.

2. Псурцева Н.В., Белова Н.В. Биотехнологические возможности использования коллекционных культур базидиомицетов // Биотехнология. — 1994. — № 7. — С. 35-39.

3. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymec and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes // J. Agr. Chem. Soc. Japan. — 1973. — 47. — № 8. — P. 467-472.

4. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль протеи-наз базидиальных грибов // Микология и фитопатология. — 1984. -№ 2. — С. 112-116.

5. Piligrim H., Darwaza M. Untersuchungen zur inhibitorsichen wirkung von wabrigen Entrakten aus basidiomyceten aur trypsin // Pharmazie. — 1985. -3. — P. 655.

6. Pilgrim H., Haasman S., Schroder K. Trypsin inhibitor activity of Basidiomycetes // Zentralb. Microbiol. — 1992. -147. -P. 400-404.

7. Vetter J. Eur Food Res Technol. — 2000. -211. — № 3. -P. 346-348.

8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram quantities of protein utilizing of protein — dye bindig // Anal. Biochim. — 1976. -72. — № 2. — P. 127-129.

9. Скоупс Р. Методы очистки белков. — М.: Мир, 1985. -С. 315.

10. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. // Материалы 17-й науч. конф. физиологов Юга РСФСР. — Ставрополь, 1969. -С. 80-82.

11. Нортроп Д., Кунитц М., Херриот Р. Кристаллические ферменты. — М., 1950. — 346 с.

12. Anson M. L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with gemoglobin // J. Gen. Physiol. — 1938. -22. — № 1. —

P. 79-89.

13. Tuppy H., Winterberger E., Wiessbauer U.

Amino-soure-p-nitroanilide als substrat fur aminopeptidasen and andere proteolytycs fement // Hoppe Selers. Z. Physiol. Chem. — 1962. -329. -№ 6. — P. 278-288.

14. Katagiri K., Takeuchi T., Sasaki M. One step purification procedure of elastase frome pancreatic powder by affinity chromatography // Anal. Biochem. — 1978. -86. — P. 159-165.

15. Erlanger B.F. The action of chymotrypsin on two New Chromogenic Substrates // Arch. Biochem. Biophys. — 1996. -115. -P. 206-210.

16. Birk Y. Trypsin Inhibitor from Garden Bean (Phaseolus vulgaris) // Methods in Enzymology. -45. — N. Y. — S.F. — L.: Acad. Press, 1976. — P. 710-716.

17. Джоржеску П., Пуэнеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. — Бухарест, 1963. — 611 с.

Кафедра физиологии и биохимии человека

Поступила 07.02.05 г.

Многие ферменты активируются специфическим протеолитическим расщеплением — Биохимия

Теперь мы обратимся к другому механизму регуляции ферментов. Многие ферменты приобретают полную ферментативную активность, поскольку они спонтанно складываются в свои характерные трехмерные формы. Напротив, другие ферменты синтезируются как неактивные предшественники, которые впоследствии активируются расщеплением одной или нескольких конкретных пептидных связей. Неактивный предшественник называется зимогеном (или проферментом ).Для расщепления не нужен источник энергии (АТФ). Следовательно, в отличие от обратимой регуляции путем фосфорилирования, даже белки, расположенные вне клеток, могут быть активированы этим способом. Другое примечательное отличие состоит в том, что протеолитическая активация, в отличие от аллостерического контроля и обратимой ковалентной модификации, происходит только один раз в жизни молекулы фермента.

Специфический протеолиз — это распространенный способ активации ферментов и других белков в биологических системах. Например:

1.

пищеварительных ферментов , которые гидролизуют белки, синтезируются как зимогены в желудке и поджелудочной железе ().

2.

Свертывание крови опосредуется каскадом протеолитических активаций, которые обеспечивают быстрый и усиленный ответ на травму.

3.

Некоторые белковые гормоны синтезируются в виде неактивных предшественников. Например, инсулин получают из проинсулина протеолитическим удалением пептида.

4.

Волокнистый белок , коллаген , основной компонент кожи и костей, происходит из проколлагена , растворимого предшественника.

5.

Многие процессы развития контролируются активацией зимогенов. Например, при превращении головастика в лягушку большое количество коллагена резорбируется из хвоста в течение нескольких дней. Точно так же большая часть коллагена расщепляется в матке млекопитающих после родов.Превращение проколлагеназы в коллагеназу , активную протеазу, точно рассчитывается по времени в этих процессах ремоделирования.

6.

Запрограммированная гибель клеток или апоптоз опосредуется протеолитическими ферментами, называемыми каспазами , которые синтезируются в форме предшественников как прокаспаз. При активации различными сигналами каспазы вызывают гибель клеток у большинства организмов, начиная с C.elegans (раздел 2.4.3) людям. Апоптоз обеспечивает средство моделирования формы частей тела в процессе развития и средство устранения клеток, вырабатывающих анти-собственные антитела или инфицированных патогенами, а также клеток, содержащих большое количество поврежденной ДНК.

Далее мы исследуем активацию и контроль зимогенов, используя в качестве примеров несколько пищеварительных ферментов, а также образование тромбов.

10.5.1. Химотрипсиноген активируется специфическим расщеплением единственной пептидной связи.

Химотрипсин — это пищеварительный фермент, который гидролизует белки в тонком кишечнике.Его механизм действия подробно обсуждался в главе 9. Его неактивный предшественник, химотрипсиноген , синтезируется в поджелудочной железе, как и некоторые другие зимогены и пищеварительные ферменты. Действительно, поджелудочная железа — один из самых активных органов в синтезе и секреции белков. Ферменты и зимогены синтезируются в ацинарных клетках поджелудочной железы и хранятся внутри мембранных гранул (). Гранулы зимогена накапливаются на вершине ацинарной клетки; когда клетка стимулируется гормональным сигналом или нервным импульсом, содержимое гранул попадает в проток, ведущий в двенадцатиперстную кишку.

Рисунок 10.31

Секреция зимогенов ацинарной клеткой поджелудочной железы.

Химотрипсиноген, одна полипептидная цепь, состоящая из 245 аминокислотных остатков, практически лишена ферментативной активности. Он превращается в полностью активный фермент, когда пептидная связь, соединяющая аргинин 15 и изолейцин 16, расщепляется трипсином (). Образующийся активный фермент, называемый π-химотрипсином, затем действует на другие молекулы π-химотрипсина. Два дипептида удаляются, чтобы получить α-химотрипсин, стабильную форму фермента.Три образующиеся цепи в α-химотрипсине остаются связанными друг с другом двумя межцепочечными дисульфидными связями. Поразительной особенностью этого процесса активации является то, что разрыв одной специфической пептидной связи превращает белок из каталитически неактивной формы в полностью активную.

Рисунок 10.32

Протеолитическая активация химотрипсиногена. Три цепи α-химотрипсина связаны двумя межцепочечными дисульфидными связями (от A к B и от B к C).

10.5.2. Протеолитическая активация химотрипсиногена приводит к образованию сайта связывания субстрата

Как расщепление одной пептидной связи активирует зимоген? Ключевые конформационные изменения, которые были выявлены при выяснении трехмерной структуры химотрипсиногена, являются результатом разрыва пептидной связи между аминокислотами 15 и 16.

1.

Новообразованная амино-концевая группа изолейцина 16 поворачивается внутрь и образует ионную связь с аспартатом 194 внутри молекулы химотрипсина ().Протонирование этой аминогруппы стабилизирует активную форму химотрипсина.

2.

Это электростатическое взаимодействие запускает ряд конформационных изменений. Метионин 192 перемещается из глубоко скрытого положения в зимогене на поверхность активного фермента, а остатки 187 и 193 становятся более протяженными. Эти изменения приводят к образованию сайта субстратной специфичности для ароматических и объемных неполярных групп. Одна сторона этого сайта состоит из остатков с 189 по 192. Эта полость для связывания части субстрата не полностью сформирована в зимогене.

3.

Тетраэдрическое переходное состояние при катализе химотрипсином стабилизируется водородными связями между отрицательно заряженным карбонильным атомом кислорода субстрата и двумя группами NH основной цепи фермента (раздел 9.1.3). Одна из этих групп NH не локализована надлежащим образом в химотрипсиногене, и поэтому оксианионная дыра в зимогене неполна.

4.

Конформационные изменения в других частях молекулы очень малы. Таким образом, включение ферментативной активности в белке может осуществляться дискретными, сильно локализованными конформационными изменениями, которые запускаются гидролизом одной пептидной связи.

Рисунок 10.33

Конформации химотрипсиногена (красный) и химотрипсина (синий). Возможно только электростатическое взаимодействие между карбоксилатом аспартата 194 и α-аминогруппой изолейцина 16, существенным для структуры активного химотрипсина (более…)

10.5.3. Образование трипсина из трипсиногена приводит к активации других зимогенов

Структурные изменения, сопровождающие активацию трипсиногена, предшественника протеолитического фермента трипсина, несколько отличаются от изменений при активации химотрипсиногена. Рентгеноструктурный анализ показал, что конформация четырех участков полипептида, составляющих около 15% молекулы, заметно изменяется при активации. Эти области, называемые доменом активации, очень гибки в зимогене, тогда как они имеют четко определенную конформацию в трипсине. Кроме того, оксианионное отверстие (раздел 9.1.3) в трипсиногене слишком далеко от гистидина 57, чтобы способствовать образованию тетраэдрического переходного состояния.

Переваривание белков в двенадцатиперстной кишке требует одновременного действия нескольких протеолитических ферментов, поскольку каждый специфичен для ограниченного числа боковых цепей. Таким образом, зимогены должны быть включены одновременно. Скоординированный контроль достигается действием трипсина как общего активатора всех зимогенов поджелудочной железы — трипсиногена, химотрипсиногена, проэластазы, прокарбоксипептидазы и пролипазы, фермента, расщепляющего липиды.Для производства активного трипсина клетки, выстилающие двенадцатиперстную кишку, секретируют фермент энтеропептидазу , который гидролизует уникальную пептидную связь лизин-изолейцин в трипсиногене, когда зимоген попадает в двенадцатиперстную кишку из поджелудочной железы. Небольшое количество трипсина, произведенного таким образом, активирует больше трипсиногена и других зимогенов (). Таким образом, образование трипсина энтеропептидазой является основной стадией активации.

Рисунок 10.34

Активация зимогена протеолитическим расщеплением.Энтеропептидаза инициирует активацию зимогенов поджелудочной железы путем активации трипсина, который затем активирует другие зимогены. Активные ферменты показаны желтым; зимогены показаны оранжевым цветом.

10.5.4. Некоторые протеолитические ферменты имеют специфические ингибиторы

Превращение зимогена в протеазу путем расщепления единственной пептидной связи является точным средством включения ферментативной активности. Однако этот этап активации необратим, и поэтому необходим другой механизм для остановки протеолиза.Специфические ингибиторы протеаз решают эту задачу. Например, ингибитор трипсина поджелудочной железы , белок 6 кДа, ингибирует трипсин, очень прочно связываясь с его активным сайтом. Константа диссоциации комплекса составляет 0,1 пМ, что соответствует стандартной свободной энергии связывания примерно -18 ккал-моль ^-1 (-75 кДж моль ^-1 ). В отличие от почти всех известных белковых ансамблей, этот комплекс не диссоциирует на составляющие его цепи при обработке денатурирующими агентами, такими как 8 M мочевина или 6 M гидрохлорид гуанидина.

Причина исключительной стабильности комплекса заключается в том, что ингибитор панкреатического трипсина является очень эффективным аналогом субстрата. Рентгеновский анализ показал, что ингибитор находится в активном центре фермента, расположенном так, что боковая цепь лизина 15 этого ингибитора взаимодействует с боковой цепью аспартата в кармане специфичности трипсина. Кроме того, существует множество водородных связей между основной цепью трипсина и цепью его ингибитора. Кроме того, карбонильная группа лизина 15 и окружающие атомы ингибитора плотно прилегают к активному центру фермента.Сравнение структуры ингибитора, связанного с ферментом, со структурой свободного ингибитора показывает, что структура практически не изменяется при связывании с ферментом (). Таким образом, ингибитор предварительно организован в структуру, которая сильно комплементарна активному центру фермента. Действительно, пептидная связь между лизином 15 и аланином 16 в ингибиторе трипсина поджелудочной железы расщепляется, но с очень медленной скоростью: период полужизни комплекса трипсин-ингибитор составляет несколько месяцев. По сути, ингибитор — это субстрат, но его внутренняя структура настолько хорошо дополняет активный центр фермента, что он очень прочно связывается и медленно поворачивается.

Рисунок 10.35

Взаимодействие трипсина с его ингибитором. Состав комплекса трипсина (желтый) и ингибитора панкреатического трипсина (красный). Лизин 15 ингибитора проникает в активный центр фермента и образует солевой мостик с аспартатом 189 в активном (подробнее …)

Почему существует ингибитор трипсина? Действительно, количество трипсина намного больше, чем у ингибитора. При каких обстоятельствах полезно ингибировать трипсин? Напомним, что трипсин активирует другие зимогены.Следовательно, очень важно предотвратить преждевременное инициирование каскада даже небольшими количествами трипсина. Молекулы трипсина, активированные в поджелудочной железе или протоках поджелудочной железы, могут серьезно повредить эти ткани, что приведет к острому панкреатиту. Некроз тканей может быть результатом активации протеолитических ферментов (а также пролипаз) трипсином, а кровотечение может быть результатом его активации эластазы. Мы видим здесь физиологическую потребность в прочном связывании ингибитора с трипсином.

Ингибитор трипсина поджелудочной железы — не единственный важный ингибитор протеазы.α ₁ — Антитрипсин (также называемый α ₁ — антипротеиназа ), белок плазмы 53 кДа, защищает ткани от переваривания эластазой, секреторным продуктом нейтрофилов (белых кровяных телец, которые поглощают бактерии). Антиэластаза было бы более точным названием для этого ингибитора, потому что он блокирует эластазу намного эффективнее, чем трипсин. Подобно ингибитору трипсина поджелудочной железы, α ₁ -антитрипсин блокирует действие целевых ферментов, почти необратимо связываясь с их активными центрами.Генетические нарушения, приводящие к дефициту α ₁ -антитрипсина, показывают, что этот ингибитор физиологически важен. Например, замена лизина на глутамат в остатке 53 в мутанте типа Z замедляет секрецию этого ингибитора из клеток печени. У людей, гомозиготных по этому дефекту, сывороточные уровни ингибитора составляют около 15% от нормы. Следствием этого является то, что избыток эластазы разрушает альвеолярные стенки в легких, переваривая эластичные волокна и другие белки соединительной ткани.

Возникшее в результате клиническое состояние называется эмфизема (также известная как деструктивная болезнь легких ). Люди с эмфиземой должны дышать намного тяжелее, чем нормальные люди, чтобы обмениваться таким же объемом воздуха, потому что их альвеолы ​​гораздо менее эластичны, чем обычно. Курение сигарет значительно увеличивает вероятность того, что даже у гетерозиготы типа Z разовьется эмфизема. Причина в том, что дым окисляет метионин 358 ингибитора (), остаток, необходимый для связывания эластазы.Действительно, эта боковая цепь метионина является приманкой, которая избирательно захватывает эластазу. Напротив, продукт окисления сульфоксида метионина не притягивает эластазу, что является поразительным следствием внедрения в белок всего одного атома кислорода. Мы рассмотрим другой ингибитор протеазы, антитромбин III, когда будем изучать контроль свертывания крови.

10.5.5. Свертывание крови осуществляется за счет каскада активаций зимогена

Ферментные каскады часто используются в биохимических системах для достижения быстрого ответа.В каскаде начальный сигнал включает серию шагов, каждая из которых катализируется ферментом. На каждом шаге сигнал усиливается. Например, если сигнальная молекула активирует фермент, который, в свою очередь, активирует 10 ферментов, а каждый из 10 ферментов, в свою очередь, активирует 10 дополнительных ферментов, после четырех шагов исходный сигнал будет усилен в 10 000 раз. Сгустки крови образуются каскадом активаций зимогена: активированная форма одного фактора свертывания крови катализирует активацию следующего ().Таким образом, для запуска каскада достаточно очень небольшого количества исходных факторов, что обеспечивает быструю реакцию на травму.

Рисунок 10.37

Каскад свертывания крови. Фибриновый сгусток образуется в результате взаимодействия внутренних, внешних и конечных общих путей. Внутренний путь начинается с активации фактора XII (фактора Хагемана) при контакте с аномальными поверхностями, вызванными травмой. (подробнее …)

Есть два способа инициирования свертывания крови: внутренний и внешний.Внутренний путь свертывания крови активируется воздействием на анионные поверхности разрыва эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов. Эти поверхности служат сайтами связывания факторов в каскаде свертывания крови. Вещества, которые выделяются из тканей в результате их травмы, запускают внешний путь свертывания крови . Внешний и внутренний пути сходятся в общей последовательности заключительных шагов, чтобы сформировать сгусток, состоящий из белка фибрина. Эти два пути взаимодействуют друг с другом in vivo.Действительно, оба необходимы для правильного свертывания, о чем свидетельствуют нарушения свертывания, вызванные дефицитом одного белка в одном из путей. Обратите внимание, что активные формы факторов свертывания крови обозначены индексом «а».

10.5.6. Фибриноген превращается тромбином в фибриновый сгусток

Наиболее хорошо охарактеризованная часть процесса свертывания — заключительный этап каскада: превращение фибриногена в фибрин тромбином, протеолитическим ферментом. Фибриноген состоит из трех глобулярных единиц, соединенных двумя стержнями ().Этот белок массой 340 кДа состоит из шести цепей: по две из Aα, Bβ и γ. Участки стержней представляют собой трехцепочечные α-спиральные спиральные спирали, повторяющийся мотив в белках. Тромбин расщепляет четыре пептидных связи аргинин-глицин в центральной глобулярной области фибриногена. При расщеплении пептид A из 18 остатков от каждой из двух цепей Aα и пептид B из 20 остатков от каждой из двух цепей Bβ высвобождаются из глобулярной области. Эти пептиды A и B называются фибринопептидами . Молекула фибриногена, лишенная этих фибринопептидов, называется мономером фибрина и имеет субъединичную структуру (αβγ) ₂ .

Рисунок 10.38

Структура молекулы фибриногена. (A) Ленточная диаграмма. Две области стержня представляют собой α-спиральные витки, соединенные с глобулярной областью на каждом конце. (B) Схематическое изображение, показывающее положения фибринопептидов A и B.

Мономеры фибрина спонтанно собираются в упорядоченные волокнистые массивы, называемые фибрином. Электронные микрофотографии и рентгенограммы под малым углом показывают, что фибрин имеет периодическую структуру, которая повторяется каждые 23 нм (). Изображения с более высоким разрешением показывают подробную структуру мономера фибрина, то, как мономеры фибрина объединяются и как эта сборка облегчается за счет удаления фибринопептидов. Гомологичные β- и γ-цепи имеют глобулярные домены на карбоксильных концах (). Эти домены имеют связывающие «дыры», которые взаимодействуют с пептидами. Β-домен специфичен для последовательностей формы H ₃ N ⁺ -Gly-His-Arg-, тогда как γ-домен связывает H ₃ N ⁺ -Gly-Pro-Arg-.Именно эти последовательности (иногда называемые «выступами») экспонируются на аминоконцевых концах β- и α-цепей соответственно при расщеплении тромбином. Выступы субъединиц α входят в отверстия субъединиц γ другого мономера с образованием протофибриллы. Эта протофибрилла удлиняется, когда выступы β-субъединиц входят в отверстия β-субъединиц других протофибрилл. Таким образом, аналогично активации химотрипсиногена, расщепление пептидной связи обнажает новые аминоконцы, которые могут участвовать в специфических взаимодействиях.Новообразованный сгусток стабилизируется за счет образования амидных связей между боковыми цепями остатков лизина и глутамина в различных мономерах.

Рисунок 10.39

Электронная микрофотография фибрина. Период 23 нм вдоль оси волокна составляет половину длины молекулы фибриногена. [Любезно предоставлено доктором Генри Слейтером.]

Рисунок 10.40

Формирование фибринового сгустка. (1) Тромбин отщепляет фибринопептиды А и В от центральной глобулы фибриногена. (2) Глобулярные домены на карбоксильных концах β- и γ-цепей взаимодействуют с «выступами», открытыми на (более…)

Эта реакция перекрестного сшивания катализируется трансглутаминазой (фактор XIII _a ) , которая сама активируется тромбином из протрансглутаминазной формы.

10.5.7. Протромбин готов к активации с помощью витамин К-зависимой модификации

Тромбин синтезируется в виде зимогена, называемого протромбином , который включает четыре основных домена с доменом сериновой протеазы на его карбоксильном конце. Первый домен называется gla доменом , тогда как домены 2 и 3 называются крингл-доменами ().Эти домены работают вместе, чтобы поддерживать протромбин в неактивной форме и направлять его в соответствующие сайты для его активации фактором X _a (сериновая протеаза) и фактором V _a (стимулирующий белок). Активация осуществляется протеолитическим расщеплением связи между аргинином 274 и треонином 275 с высвобождением фрагмента, содержащим первые три домена, и расщеплением связи между аргинином 323 и изолейцином 324 (аналогично ключевой связи в химотрипсиногене) с образованием активного тромбина.

Рисунок 10.41

Модульная структура протромбина. Разрыв двух пептидных связей дает тромбин. Все остатки γ-карбоксиглутамата находятся в домене gla.

Витамин К (разделы 8.6.2 и) уже много лет известен как необходимый для синтеза протромбина и некоторых других факторов свертывания крови. Результаты исследований аномального протромбина, синтезируемого в отсутствие витамина К или в присутствии антагонистов витамина К, таких как дикумарол, выявили механизм действия этого витамина. Дикумарол содержится в испорченном доннике донника и вызывает смертельную геморрагическую болезнь у крупного рогатого скота, питающегося этим сеном. Это производное кумарина используется в клинической практике в качестве антикоагулянта для предотвращения тромбозов у ​​пациентов, склонных к образованию сгустков. Дикумарол и такие родственные антагонисты витамина К, как варфарин , также служат в качестве эффективных ядов для крыс. Коровы, которых кормили дикумаролом, синтезируют аномальный протромбин, который не связывает Ca ²⁺ , в отличие от нормального протромбина.Это различие в течение некоторого времени вызывало недоумение, потому что аномальный протромбин имеет такое же количество аминокислотных остатков и дает такой же аминокислотный анализ после кислотного гидролиза, как и нормальный протромбин.

Рис. 10.42

Структуры витамина К и двух антагонистов, дикумарола и варфарина.

Исследования ядерного магнитного резонанса показали, что нормальный протромбин содержит γ-карбоксиглутамат , ранее неизвестный остаток, который не был обнаружен, поскольку его вторая карбоксильная группа теряется при кислотном гидролизе.В аномальном протромбине, образовавшемся после приема антикоагулянтов, отсутствует эта модифицированная аминокислота. Фактически, первые 10 остатков глутамата в аминоконцевой области протромбина карбоксилируются до γ-карбоксиглутамата витамин K-зависимой ферментной системой (). Реакция зависимого от витамина К карбоксилирования превращает глутамат, слабый хелатор Ca ^{2 +} , в γ-карбоксиглутамат, гораздо более сильный хелатор .Таким образом, протромбин способен связывать Ca ²⁺ , но каков эффект этого связывания? Связывание Ca ²⁺ протромбином закрепляет зимоген на фосфолипидных мембранах, полученных из тромбоцитов после повреждения. Связывание протромбина с поверхностями фосфолипидов имеет решающее значение, поскольку оно приближает протромбин к двум белкам свертывания, которые катализируют его превращение в тромбин. Протеолитическая активация протромбина удаляет кальций-связывающий домен и высвобождает тромбин из мембраны, чтобы он мог расщеплять фибриноген и другие мишени.

Рис. 10.43

Кальций-связывающая область протромбина. Протромбин связывает ионы кальция с модифицированной аминокислотой γ-карбоксиглутаматом (красный).

10.5.8. Гемофилия выявила ранний этап свертывания крови

Некоторые важные открытия в выяснении путей свертывания крови были сделаны в результате исследований пациентов с нарушениями свертываемости крови. Классическая гемофилия, или гемофилия A, наиболее известный дефект свертывания крови, передается генетически как рецессивный признак, связанный с полом. При классической гемофилии фактор VIII (антигемофильный фактор) внутреннего пути отсутствует или имеет заметно сниженную активность. Хотя фактор VIII сам по себе не является протеазой, он заметно стимулирует активацию фактора X, последней протеазы внутреннего пути, фактором IX _a , сериновой протеазой (). Таким образом, активация внутреннего пути сильно нарушена при гемофилии.

Рисунок 10.44

Действие антигемофильного фактора. Антигемофильный фактор (VIII) стимулирует активацию фактора X фактором IX _a .Интересно отметить, что активность фактора VIII заметно увеличивается при ограниченном протеолизе тромбином и фактором X _a . This (подробнее …)

В прошлом больных гемофилией лечили переливаниями концентрированной фракции плазмы, содержащей фактор VIII. Эта терапия сопряжена с риском заражения. Действительно, многие больные гемофилией заразились гепатитом и СПИДом. Срочно требовался более безопасный препарат фактора VIII. С использованием методов биохимической очистки и рекомбинантных ДНК ген фактора VIII был выделен и экспрессирован в клетках, выращенных в культуре.Рекомбинантный фактор VIII, очищенный из этих клеток, в значительной степени заменил концентраты плазмы при лечении гемофилии.

Отчет о геморрагическом предрасположении, существующем в некоторых семьях —

«Около семидесяти или восьмидесяти лет назад женщина по имени Смит поселилась в окрестностях Плимута, штат Нью-Гэмпшир, и передала своим потомкам следующую идиосинкразию. Она заметила, что это одна из причин, которой, к сожалению, подвержена ее семья, и которая была не только источником большой заботы, но и часто причиной смерти.Если на коже некоторых из них будет нанесена наименьшая царапина, в конечном итоге последует кровоизлияние, как если бы была нанесена самая большая рана…. Удивительно то обстоятельство, что только мужчины подвержены этой странной привязанности, и что все они не подвержены ей…. Хотя женщины освобождены от этого налога, они все же способны передать его своим детям мужского пола ».

Джон Отто (1803)

10.5.9. Необходимо точно регулировать процесс свертывания крови

Между кровоизлиянием и тромбозом есть тонкая грань.Сгустки должны образовываться быстро, но при этом оставаться в зоне повреждения. Какие механизмы обычно ограничивают образование сгустка в месте повреждения? Лабильность факторов свертывания в значительной степени способствует контролю свертывания. Активированные факторы недолговечны, потому что они разбавляются кровотоком, удаляются печенью и разлагаются протеазами. Например, факторы стимулирующих белков V _a и VIII _a перевариваются протеином C, протеазой, которая включается под действием тромбина. Таким образом, тромбин выполняет двойную функцию: он катализирует образование фибрина и инициирует дезактивацию каскада свертывания крови.

Специфические ингибиторы факторов свертывания также имеют решающее значение в прекращении свертывания. Наиболее важным из них является антитромбин III , белок плазмы, который инактивирует тромбин, образуя с ним необратимый комплекс. Антитромбин III напоминает α ₁ -антитрипсин, за исключением того, что он ингибирует тромбин гораздо сильнее, чем эластазу.Антитромбин III также блокирует другие сериновые протеазы в каскаде свертывания, а именно факторы XII _a , XI _a , IX _a и X _a . Ингибирующее действие антитромбина III усиливается гепарином , отрицательно заряженным полисахаридом, обнаруженным в тучных клетках у стенок кровеносных сосудов и на поверхности эндотелиальных клеток (). Гепарин действует как антикоагулянт , увеличивая скорость образования необратимых комплексов между антитромбином III и факторами свертывания сериновой протеазы.Антитрипсин и антитромбин представляют собой серпинов, семейство ser ine p rotease в гибиторах.

Рис. 10.45

Электронная микрофотография тучной клетки. Гепарин и другие молекулы в плотных гранулах высвобождаются во внеклеточное пространство, когда клетка запускается для секреции. [Любезно предоставлено Линн Мерсер.]

Важность соотношения тромбина и антитромбина иллюстрируется на примере 14-летнего мальчика, умершего от нарушения свертываемости крови из-за мутации в его α ₁ -антитрипсин, который обычно ингибирует эластазу (Раздел 10.5.4). Метионин 358 в связывающем кармане α ₁ -антитрипсина для эластазы был заменен аргинином, что привело к изменению специфичности с ингибитора эластазы на ингибитор тромбина. α ₁ -Антитрипсиновая активность обычно заметно увеличивается после травмы, чтобы противодействовать избытку эластазы, возникающему из-за стимулированных нейтрофилов. Мутантный α ₁ -антитрипсин привел к падению активности тромбина пациента до такого низкого уровня, что последовало кровотечение. Мы видим здесь поразительный пример того, как изменение одного остатка в белке может резко изменить специфичность, и пример критической важности наличия правильного количества ингибитора протеазы.

Антитромбин ограничивает степень образования сгустков, но что происходит с самими сгустками? Сгустки не являются постоянными структурами, они предназначены для растворения при восстановлении структурной целостности поврежденных участков. Фибрин расщепляется плазмином , сериновой протеазой , которая гидролизует пептидные связи в областях спиральной спирали. Молекулы плазмина могут диффундировать через водные каналы в пористом фибриновом сгустке, разрезая доступные соединительные стержни. Плазмин образуется в результате протеолитической активации плазминогена , неактивного предшественника , имеющего высокое сродство к фибриновым сгусткам.Это преобразование осуществляется тканевым активатором плазминогена (TPA), белком массой 72 кДа, который имеет доменную структуру, близкую к структуре протромбина ().

Рисунок 10.46

Модульная структура тканевого активатора плазминогена (TPA).

Однако домен, который нацеливает TPA на фибриновые сгустки, заменяет нацеленный на мембрану gla домен протромбина. TPA, связанный с фибриновыми сгустками, быстро активирует прилипший плазминоген. Напротив, TPA очень медленно активирует свободный плазминоген.Ген TPA был клонирован и экспрессирован в культивируемых клетках млекопитающих. Результаты клинических исследований показали, что TPA, вводимый внутривенно в течение часа после образования тромба в коронарной артерии, заметно увеличивает вероятность выживания после сердечного приступа ().

Рисунок 10.47

Влияние тканевого плазминогенового фактора. TPA приводит к растворению сгустков крови, как показывают рентгеновские снимки кровеносных сосудов в сердце (A) до и (B) через 3 часа после введения TPA.Положение сгустка отмечено стрелкой (подробнее …)

Экзокринные выделения поджелудочной железы

Экзокринные выделения поджелудочной железы

Панкреатический сок состоит из двух секреторных продуктов, важных для правильного пищеварения: пищеварительных ферментов и бикарбоната. Ферменты синтезируются и секретируются экзокринными ацинарными клетками, тогда как бикарбонат секретируется эпителиальными клетками, выстилающими небольшие протоки поджелудочной железы.

Пищеварительные ферменты

Поджелудочная железа выделяет великолепную батарею ферментов, которые в совокупности способны восстанавливать практически все усвояемые макромолекулы до форм, которые способны или почти способны усваиваться.Для эффективного пищеварения критически важны три основные группы ферментов:

1. Протеазы

Переваривание белков инициируется пепсином в желудке, но основная часть переваривания белков происходит за счет протеаз поджелудочной железы. Несколько протеаз синтезируются в поджелудочной железе и секретируются в просвет тонкой кишки. Двумя основными протеазами поджелудочной железы являются трипсин и химотрипсин , которые синтезируются и упаковываются в секреторные везикулы как неактивные проферменты трипсиноген и химотрипсиноген.

Как и следовало ожидать, протеазы — это довольно опасные ферменты, которые могут быть в клетках, и упаковка неактивного предшественника — это способ клетки безопасно обращаться с этими ферментами. Секреторные везикулы также содержат ингибитор трипсина, который служит дополнительной защитой, если часть трипсиногена активируется до трипсина; после экзоцитоза этот ингибитор растворяется и становится неэффективным — штифт выходит из гранаты.

Когда трипсиноген и химотрипсиноген попадают в просвет тонкой кишки, они должны быть преобразованы в свои активные формы для переваривания белков.Трипсиноген активируется ферментом энтерокиназой , который встроен в слизистую оболочку кишечника.

После образования трипсина активирует химотрипсиноген, а также дополнительные молекулы трипсиногена. Конечным результатом является довольно взрывное появление активной протеазы, когда секреты поджелудочной железы достигают тонкой кишки.

Трипсин и химотрипсин расщепляют белки на пептиды, а пептиды на более мелкие пептиды, но они не могут переваривать белки и пептиды до отдельных аминокислот.Некоторые из других протеаз поджелудочной железы, например карбоксипептидаза, обладают такой способностью, но окончательное расщепление пептидов до аминокислот в значительной степени является эффектом пептидаз на поверхности эпителиальных клеток тонкого кишечника. Подробнее об этом позже.

2. Липаза поджелудочной железы

Основным компонентом диетического жира является триглицерид или нейтральный липид. Молекула триглицерида не может всасываться напрямую через слизистую оболочку кишечника. Скорее, сначала он должен быть переварен до 2-моноглицерида и двух свободных жирных кислот.Фермент, выполняющий этот гидролиз, — это липаза поджелудочной железы, которая доставляется в просвет кишечника в составе панкреатического сока.

В просвете кишечника также должно присутствовать достаточное количество солей желчных кислот, чтобы липаза могла эффективно переваривать пищевые триглицериды и чтобы полученные жирные кислоты и моноглицериды всасывались. Это означает, что нормальное пищеварение и всасывание пищевых жиров в значительной степени зависят от секреции как поджелудочной железы, так и печени.

Липаза поджелудочной железы недавно была в центре внимания как мишень для лечения ожирения. Лекарственное средство орлистат (Ксеникал) представляет собой ингибитор липазы поджелудочной железы, который препятствует перевариванию триглицеридов и тем самым снижает всасывание пищевых жиров. Клинические испытания подтверждают утверждение, что ингибирование липазы может привести к значительному снижению массы тела у некоторых пациентов.

3. Амилаза

Основным пищевым углеводом для многих видов является крахмал, форма хранения глюкозы в растениях.Амилаза (технически альфа-амилаза) — это фермент, который гидролизует крахмал до мальтозы (дисахарид глюкоза-глюкоза), а также трисахарид мальтотриоза и небольшие фрагменты точек ветвления, называемые предельными декстринами. Основным источником амилазы у всех видов является панкреатический секрет, хотя амилаза также присутствует в слюне некоторых животных, включая человека.

Другие ферменты поджелудочной железы

Помимо протеаз, липазы и амилазы, поджелудочная железа вырабатывает множество других пищеварительных ферментов, включая рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу, желатиназу и эластазу.

Бикарбонат и вода

Эпителиальные клетки протоков поджелудочной железы являются источником бикарбоната и воды, выделяемых поджелудочной железой. Бикарбонат является основой и имеет решающее значение для нейтрализации кислоты, поступающей в тонкий кишечник из желудка. Механизм, лежащий в основе секреции бикарбоната, по существу такой же, как и для секреции кислоты париетальными клетками желудка, и зависит от фермента карбоангидразы. В клетках протока поджелудочной железы бикарбонат секретируется в просвет протока и, следовательно, в панкреатический сок.

Отправляйте комментарии [email protected]

Украинский перевод этой страницы Елены Червоной доступен в украинском переводе

7.2: Химотрипсин — Chemistry LibreTexts

Химотрипсин — это пищеварительный фермент, принадлежащий к суперсемейству ферментов, называемых сериновыми протеазами. Он использует активный остаток серина для проведения гидролиза на С-конце ароматических аминокислот других белков. Химотрипсин — это протеазный фермент, который расщепляет фенилаланин (F), триптофан (W) и тирозин (Y) на пептидных цепях на С-конце.Он проявляет специфичность к ароматическим аминокислотам из-за своего гидрофобного кармана.

Введение

Химотрипсин — один из наиболее изученных ферментов из-за его двухфазной кинетики: пре-установившегося состояния и установившегося состояния. Изучение этих двух кинетических состояний свидетельствует о механизме «пинг-понг», образовании ковалентных комплексов, ведущих к реакциям ковалентного гидролиза, и скорости каталитических реакций. Синтез химотрипсина происходит преимущественно в поджелудочной железе. Однако вместо активной формы он вырабатывается в виде неактивного зимогена, называемого химотрипсиногеном, чтобы предотвратить переваривание его протеазной активностью поджелудочной железы.При секреции в просвет тонкой кишки он превращается в активную форму другим ферментом, называемым трипсином. Эта зависимость другого фермента от активации протеазы является обычным для организма способом предотвращения переваривания органов и других вредных ферментативных побочных эффектов.

Химотрипсин действует через общий механизм, известный как механизм пинг-понга (Рисунок \ (\ PageIndex {1} \)), посредством которого фермент реагирует с субстратом с образованием промежуточного фермента. Этот промежуточный продукт имеет свойства, отличные от свойств исходного фермента, поэтому для восстановления исходной ферментативной активности он должен реагировать со вторичным субстратом.Этот процесс проиллюстрирован ниже:

Рисунок \ (\ PageIndex {1} \) : Общий механизм пинг-понга

Более конкретно, химотрипсин действует посредством особого типа механизма пинг-понга, называемого ковалентным гидролизом. Это означает, что фермент сначала образует ковалентную связь с целевым субстратом, вытесняя более стабильный фрагмент в раствор. Этот комплекс фермент-субстрат называется промежуточным ферментом. Промежуточный продукт затем вступает в реакцию с водой, которая вытесняет оставшуюся часть исходного субстрата и преобразует исходный фермент.

Химотрипсин, как и большинство ферментов, зависит от типа субстратов, с которыми он реагирует. Как протеаза, он расщепляет полипептиды, и присущая ему специфичность позволяет ему действовать только на карбокси-конце ароматических остатков. Это довольно сложный механизм, который лучше всего объяснить в серии шагов.

1. Мишень входит в активный центр химотрипсина и удерживается там за счет гидрофобных взаимодействий между незащищенными неполярными группами остатков фермента и неполярной ароматической боковой цепью субстрата.Важно отметить водородную связь между азотом Шиффа на гистидине-57 и кислородной боковой цепью серина-195.

2. С помощью водородной связи гистидин-серин гидроксильная группа серина-195 выполняет нуклеофильную атаку на карбонильный углерод ароматической аминокислоты, одновременно передавая гидроксильный водород на гистидиновый азот Шиффа. Эта атака подталкивает пи-карбонильные электроны к карбонильному кислороду, образуя короткоживущий промежуточный продукт, состоящий из c-концевого углерода с четырьмя одинарными связями: анион кислорода, бета-углерод ароматической аминокислоты, n-конец последующая аминокислота белка-субстрата и кислород боковой цепи серин-195.

3. Этот промежуточный продукт недолговечен, поскольку электроны оксианиона реформируют пи-связь с С-концом ароматической аминокислоты. Связь между карбокси-концом ароматической аминокислоты и n-концом последующего остатка разрывается, и его электроны используются для извлечения водорода из протонированного азота Шиффа на гистидине-57. Связи между карбонильным углеродом и кислородом серина-195 остаются в сложноэфирной конфигурации. Это называется промежуточным продуктом ацил-фермента.С-концевая сторона полипептида теперь может диссоциировать от активного центра фермента.

4. Молекулы воды теперь могут входить в активный центр и связываться с ним посредством водородной связи между атомами водорода воды и азотом Шиффа гистидина-57.

5. Кислород воды теперь производит нуклеофильную атаку на карбонильный углерод промежуточного ацил-фермента, толкая пи-электроны карбонила на карбонильный углерод, когда гистидин-57 извлекает один протон из воды.При этом образуется еще один четвертичный углерод, ковалентно связанный с серином, гидроксилом, оксианионом и ароматической аминокислотой. Протон недавно протонированного гистидина-57 теперь может образовывать водородную связь с кислородом серина.

6. Электроны оксианиона реформируют карбонильную пи-связь, разрывая связь между карбонильным углеродом и сериновым гидроксилом. Электроны в этой связи используются кислородом серина для депротонирования азота гистидина Шиффа и преобразования исходного фермента.Субстрат больше не имеет сродства к активному центру и вскоре отделяется от комплекса.

Кинетика

Эксперименты проведены в 1953 г. Б.С. Хартли и Б.А. Килби исследовать кинетику гидролиза, катализируемого химотрипсином. Вместо использования полипептидной цепи в качестве субстрата они использовали нитрофениловый эфир, п-нитрофенилацетат, который напоминает ароматическую аминокислоту. Гидролиз этого соединения химотрипсином по карбонильной группе дает ацетат и нитрофенолят, последний из которых поглощает свет с длиной волны около 400 нм, и его концентрацию, таким образом, можно измерить спектрофотометрически (рисунок \ (\ PageIndex {2} \)).

Рисунок \ (\ PageIndex {2} \) : Каталитическая активность гидролиза п-нитропенолата под

Спектрофотометрический анализ химотрипсина, действующего на нитрофенилацетат, показал, что нитрофенолат производился со скоростью, не зависящей от концентрации субстрата, что доказывает, что единственный фактор, влияющий на скорость образования продукта, — это концентрация фермента; это типично для кинетики фермент-субстрат. Однако, когда наклон графика оптической плотности 0-го порядка был прослежен до начальной точки (время = 0), было обнаружено, что начальная концентрация нитрофенолята не равнялась 0.Фактически, он показал стехиометрическое соотношение 1: 1 с количеством химотрипсина, использованного в анализе. Это можно объяснить только тем фактом, что гидролиз химотрипсином является двухфазным по своей природе, что означает, что он протекает в две отдельные стадии.

1. Первый этап, который описывает начальный выброс нитрофенолата , наблюдаемый на графике абсорбции Хартли и Килби, является самым быстрым. Атака нитрофенилацетатного субстрата химотрипсином немедленно расщепляет нитрофенолятный фрагмент и оставляет ацетатную группу, присоединенную к химотрипсину, делая фермент неактивным.
2. Было установлено, что вторая стадия включает гидролиз ацетатной группы инактивированного химотрипсина с целью регенерации исходного фермента.

Для аналитического определения скорости катализа необходимо определить все субстраты, продукты и промежуточные соединения. См. Рисунок ниже:

Использование этих сокращений упрощает кинетический анализ.

1. Начальное количество фермента можно представить как сумму свободного фермента, связанного фермента и неактивного промежуточного продукта.* ES] \]

5. Последний вывод, который можно сделать из анализа данных измеренной кинетики (рис. \ (\ PageIndex {2} \)), заключается в том, что первая стадия реакции быстро уравновешивается, и, таким образом, можно описать изменение связанного субстрата. в следующем уравнении. Это основной принцип при анализе кинетики химотрипсина и повсеместный механизм в катализе биологическим ферментом .

\ [\ dfrac {d [ES]} {dt} = k_1 [E] [S] -k _ {- 1} [ES] = 0 \]

6. Где:

\ [\ dfrac {k _ {- 1}} {k_1} = K_s = \ dfrac {[E] [S]} {[ES]} \]

7.Комбинируя все эти величины, мы можем получить каталитическую константу скорости как:

\ [k_ {cat} = \ dfrac {k_2k_3} {k_2 + k_3} \]

8. При гидролизе сложного эфира \ (k_3 >> k_2 \), поэтому результирующая каталитическая константа скорости упрощается до:

\ [k_ {cat} = k_2 \]

, что согласуется с наблюдаемой кинетикой нулевого порядка на рисунке \ (\ PageIndex {2} \).

Таблица \ (\ PageIndex {1} \) : Кинетические константы катализируемого химотрипсином гидролиза п-нитрофенилтриметилацетата при pH 8.2

к 2	0,37 ± 0,11 с -1
к 3	(1,3 ± 0,02) × 10 -4 с -1
К с	(1,6 ± 0,5) × 10 -3
k кот	1,3 × 10-4 с -1
К M	5.6 × 10 -7
0,01 М трис-HCL буфер, ионная сила 0,06, 25,6 ± 0,1 ° C, 1,8% (об. / Об.) Ацетонитрил-вода. От M.L. Бендер, Ф.Дж. Кезды и Ф.С. Wedler, J. Chem. Educ. 44, 84 (1967 )

Список литературы

1. Чанг, Раймонд. Физическая химия для биологических наук. Сансалито, Калифорния: Университетская наука, 2005.
2. Сегель, Ирвин Х., Кинетика ферментов: поведение и анализ ферментных систем быстрого равновесия и устойчивого состояния (библиотека Wiley Classics)
3. Гаррет, Реджинальд.Гришман, Чарльз. Биохимия. Университет Вирджинии, 2007 г.
4. Уитакер, Джон. Принципы энзимологии для пищевых наук. Калифорнийский университет в Дэвисе. 1994
5. «Механизм химотрипсина» можно просмотреть по адресу: www.sumanasinc.com/webcontent…motrypsin.html
6. Sumanas Inc, просмотр 25 февраля 2009 г.
7. M.L. Бендер, Ф.Дж. Кезды и Ф.С. Wedler, J. Chem. Educ. 44, 84 (1967)

Химотрипсин | Энциклопедия.com

Описание

Химотрипсин — это пищеварительный фермент, расщепляющий белки (т.е. это протеолитический фермент; его также можно назвать протеазой). Он естественным образом вырабатывается поджелудочной железой в организме человека. Однако его также можно принимать в качестве ферментной добавки для улучшения здоровья и пищеварения и помощи в лечении различных заболеваний.

Поджелудочная железа, вырабатывающая химотрипсин и другие пищеварительные ферменты , представляет собой пищеварительный орган в брюшной полости, расположенный чуть ниже желудка.Его основная задача — производить ферменты, необходимые для переваривания и усвоения пищи. Каждый день поджелудочная железа выделяет в тонкий кишечник около 1,5 кварты (1,4 л) панкреатического сока, состоящего из ферментов, воды и электролитов (в первую очередь бикарбоната). Ферменты секретируются в неактивной форме (в виде проферментов), поэтому они не переваривают поджелудочную железу. Поджелудочная железа секретирует ингибитор, чтобы ферменты не активировались слишком рано. Когда панкреатический сок достигает тонкой кишки, ферменты активируются.Тонкий кишечник не переваривается, потому что он содержит защитную слизистую оболочку. Однако самопереваривание может произойти, если проток поджелудочной железы заблокирован или если поджелудочная железа повреждена. Проферменты могут подавлять ингибитор, вызывая активацию ферментов в поджелудочной железе. Это состояние, называемое острым панкреатитом , может привести к пожизненной недостаточности поджелудочной железы.

Ферменты, выделяемые поджелудочной железой, расщепляют пищу, разрывая химические связи, удерживающие молекулы пищи вместе.Выделяемые ферменты включают липазу, которая вместе с желчью переваривает жир; амилазы, расщепляющие молекулы крахмала на более мелкие сахара; и протеаза, которая расщепляет белковые молекулы на дипептиды и несколько отдельных аминокислот . Помимо химотрипсина, другие ферменты протеазы, секретируемые поджелудочной железой, включают трипсин и карбоксипептидазу.

Химотрипсин, как фермент гидролазного типа (что означает, что он добавляет молекулу воды в процессе распада) действует, катализируя гидролиз пептидных связей белков в тонком кишечнике.Он селективен для пептидных связей с ароматическими или большими гидрофобными боковыми цепями на карбоксильной стороне этой связи. Химотрипсин также катализирует гидролиз сложноэфирных связей. Химотрипсин не переваривает белки крови из-за защитных факторов в крови, которые блокируют фермент.

Общее применение

Как правило, химотрипсин в основном используется в качестве вспомогательного средства пищеварения и в качестве противовоспалительного агента. Присутствие и количество химотрипсина в стуле человека иногда измеряется в диагностических целях как проверка функции поджелудочной железы.Анализ фекального химотрипсина неинвазивен, в отличие от некоторых других тестов функции поджелудочной железы.

Химотрипсин, наряду с другими ферментами поджелудочной железы, чаще всего используется при лечении недостаточности поджелудочной железы. Недостаточность поджелудочной железы характеризуется нарушением пищеварения, мальабсорбцией и выводом непереваренной пищи с калом, дефицитом питательных веществ, газом , вздутием живота и дискомфортом. Дефицит поджелудочной железы также встречается у людей с муковисцидозом, редким наследственным заболеванием.Это может также произойти у людей с хроническим панкреатитом, а также у пожилых людей. Другие состояния, которые могут привести к дефициту химотрипсина, включают физические травмы, химиотерапию и хронический стресс .

Переваривание крахмала и жиров может осуществляться без помощи ферментов поджелудочной железы; однако ферменты протеазы (т.е. химотрипсин, трипсин и карбоксипептидаза) необходимы для правильного переваривания белка. Неполное переваривание белков может привести к развитию аллергии и образованию токсичных веществ, образующихся в результате гниения, расщепления белковых материалов бактериями.Ферменты протеазы и другие кишечные секреты также необходимы для защиты тонкого кишечника от паразитов, таких как бактерии, дрожжи, простейшие и кишечные черви . Лабораторный анализ образца стула вместе с физическими симптомами используется для оценки функции поджелудочной железы.

В качестве противовоспалительного агента химотрипсин и другие ферменты протеазы предотвращают повреждение тканей во время воспаления и образование фибриновых сгустков. Ферменты протеазы участвуют в расщеплении фибрина в процессе, называемом фибринолизом.Фибрин вызывает образование стенки вокруг области воспаления, что приводит к закупорке кровеносных и лимфатических сосудов, что приводит к отеку. Фибрин также может вызывать образование тромбов. При аутоиммунных заболеваниях ферменты протеазы способствуют разрушению иммунных комплексов, которые представляют собой антитела, вырабатываемые иммунной системой, связанные с соединениями, с которыми они связываются (антигенами). Высокий уровень иммунных комплексов в крови связан с аутоиммунными заболеваниями.

В частности, химотрипсин используется для:

• Помощь в пищеварении.
• Лечит воспаление и уменьшает отек (например, травмы мягких тканей, острые травмы, растяжения, ушибы, гематомы, экхимозы, инфекции, отек век и гениталий, мышечные спазмы и спортивные травмы).
• Лечит артрит и другие аутоиммунные заболевания, такие как волчанка, склеродермия и рассеянный склероз.
• Лечит язвы и абсцессы.
• Разжижает выделения слизи.
• Лечит энтерозойных червей и других паразитов пищеварительного тракта.
• Лечить рак (спорное использование, которое требует гораздо больше научных исследований, хотя химотрипсин может быть полезным в облегчении последствий лучевой терапии или химиотерапии).
• Лечить опоясывающий лишай и прыщи.
• Уменьшает эффекты солнечных лучей и пигментных пятен.

Препараты

Химотрипсин получают из свежей поджелудочной железы свиньи, говядины или быка. Его можно принимать перорально, местно или в виде инъекций (только врачом в тяжелых ситуациях, угрожающих жизни), но обычно его принимают перорально в форме таблеток.Таблетка может быть без оболочки, микрокапсулированной или энтеросолюбильной (для предотвращения переваривания в желудке и высвобождения фермента в тонком кишечнике). Другие формы включают гранулы с покрытием, порошок, капсулы и жидкости. Кремы и мази используются для расщепления белков и удаления мертвых тканей, образовавшихся в результате ожогов , ран и абсцессов. Ферментный препарат следует хранить в плотно закрытой таре с влагонепроницаемым вкладышем в сухом прохладном месте. В открытом контейнере, хранящемся должным образом, ферментная активность должна сохраняться в течение двух-трех месяцев.

Обычно химотрипсин включают в комбинации с другими ферментами. Типичный состав может включать: химотрипсин (0,5–1 мг), бромелаин, (растительная протеаза) (25–45 мг), панкреатин (смесь многих ферментов поджелудочной железы) (100 мг), папаин (растительная протеаза, сходная по содержанию действие на химотрипсин) (25–60 мг) и трипсин (протеаза поджелудочной железы) (24 мг). Составы могут также включать витамины, травы, фитохимические вещества и другие питательные вещества для повышения активности ферментной добавки.

При выборе добавки следует учитывать активность фермента. Активность обычно указывается в единицах; однако единого стандарта для уровня активности ферментов не существует. К признанным руководствам по измерению активности ферментов относятся Кодекс пищевых химикатов (FCC), Фармакопея США (USP), Международная федерация фармакопеи (FIP), Британская фармакопея (BP) и Японская фармакопея (JP). Например, Фармакопея США установила строгое определение уровня активности, который должен указываться в ферментной добавке.Продукт химотрипсина 1X должен содержать не менее 25 единиц USP для активности химотрипсина. Препарату с более высокой активностью дается целое число, кратное его силе. Например, неразбавленный экстракт полной концентрации, который в 10 раз сильнее, чем стандарт USP, будет называться 10X USP. Потребитель может сравнивать уровни активности ферментов среди ферментных продуктов в рамках единой системы рекомендаций, но, к сожалению, эта информация не является взаимозаменяемой между системами рекомендаций.

Требуемая доза будет зависеть от количества (количество в мг) и качества (уровня активности) фермента в препарате, который обычно представляет собой таблетку.Доза также будет зависеть от состояния, которое лечат. В большинстве случаев при пероральном приеме внутрь и при местном применении можно следовать указаниям на этикетке флакона или тюбика. Таблетки с энтеросолюбильным покрытием следует проглатывать, а не жевать и не измельчать. Таблетки также следует запивать как минимум 8 унциями воды, чтобы активировать фермент. Химотрипсин, принимаемый для улучшения пищеварения, обычно принимается непосредственно перед, во время или сразу после еды или перед сном. При правильной дозировке улучшение пищеварения должно быть отмечено в течение нескольких часов.

При воспалительных или хронических состояниях химотрипсин следует принимать натощак, либо за час до еды, либо как минимум через два часа после еды. Когда химотрипсин принимается при воспалительном заболевании, некоторое улучшение может быть отмечено в течение трех-семи дней. Людям с хроническими заболеваниями, такими как артрит, может потребоваться от одного до трех месяцев или более, чтобы заметить изменение состояния.

Меры предосторожности

Химотрипсин обычно хорошо переносится и не вызывает каких-либо значительных побочных эффектов.Однако, поскольку безопасная доза не установлена, ее следует использовать только при очевидной необходимости.

Люди, которым не следует использовать ферментную терапию , включают людей с наследственными нарушениями свертывания крови, такими как гемофилия, тех, кто страдает нарушениями свертывания крови, тех, кто собирается или перенес операцию, тех, кто принимает антикоагулянтную терапию, всех, кто страдает аллергией на белок, и беременные женщины или кормящие грудью. Поскольку мало что известно о влиянии ферментной терапии на детей, было бы благоразумно не давать детям ферментные добавки.

При выходе из строя защитных механизмов от самопереваривания в организме химотрипсин использовать нельзя. Например, если у пациента есть язва желудка, терапию химотрипсином следует прекратить.

Побочные эффекты

По всей видимости, долгосрочных побочных эффектов от терапии химотрипсином не наблюдается, если соблюдаются меры предосторожности при его применении. Исследования показали, что в рекомендуемых дозах ферменты не могут быть обнаружены в анализе крови через 24–48 часов. Временные побочные эффекты, которые могут возникнуть (но которые должны исчезнуть при прекращении терапии или уменьшении дозировки), включают изменения цвета, консистенции и запаха стула.Некоторые люди могут испытывать желудочно-кишечные расстройства, такие как метеоризм, чувство переполнения, диарея, запор или тошнота . При приеме высоких доз могут возникнуть незначительные аллергические реакции, например, покраснение кожи.

Взаимодействия

Химотрипсин чаще всего используется в сочетании с другими ферментами для повышения его лечебного потенциала. Кроме того, для стимуляции активности химотрипсина рекомендуется хорошо сбалансированная диета или использование витаминных и минеральных добавок.

Было обнаружено, что некоторые виды семян, в том числе семена жожоба и дикой сои, содержат белки, ингибирующие активность химотрипсина. Эти белки можно инактивировать кипячением семян.

КЛЮЧЕВЫЕ ТЕРМИНЫ

Экхимоз (множественное число, экхимозы)

— медицинский термин, обозначающий синяк или изменение цвета кожи, вызванное просачиванием крови из разорванных капилляров под кожей.

Химотрипсин не следует использовать вместе с ацетилцистеином, лекарством, используемым для разжижения слизи в легких.Его также нельзя использовать вместе с антикоагулянтами (разжижающими кровь) препаратами, так как это усиливает их действие. Хлорамфеникол, лекарство, используемое для лечения глазных инфекций, может снизить эффективность офтальмологических растворов химотрипсина.

Ресурсы

КНИГИ

Блэнд, Джеффри. Пищеварительные ферменты. New Canaan, CT: Keats Publishing, Inc., 1993.

Cichoke, Anthony J. The Complete Book of Enzyme Therapy. Парк Гарден-Сити, Нью-Йорк: Эйвери Паблишинг Груп, 1999.

ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ИЗДАНИЯ

Дешимару, М., Р. Ханамото, К. Кусано и др. «Очистка и характеристика ингибиторов протеиназ из семян дикой сои (Glycine Soja)». Биология, биотехнология и биохимия 66 (сентябрь 2002 г.): 1897-1903.

Фуджино, Х., Т. Аоки и Х. Ватабе. «Высокочувствительный анализ протеаз с использованием стафилококкового белка, слитого с усиленным зеленым флуоресцентным белком». Биология, биотехнология и биохимия 66 (июль 2002 г.): 1601-1604.

Шреста, М. К., И. Пери, П. Смирнов и др. «Белки семян жожоба, связанные с протеолитической и протеазно-ингибирующей активностями». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии 50 (25 сентября 2002 г.): 5670-5675.

Zintl, A., C. Westbrook, H. E. Skerrett, et al. «Лечение химотрипсином и нейраминидазой ингибирует вторжение клеток-хозяев Babesia divergens (Phylum Apicomplexa)». Parasitology 125 (июль 2002 г.): 45-50.

ОРГАНИЗАЦИИ

Американская диетическая ассоциация (ADA).216 West Jackson Blvd., Suite 800, Chicago, IL 60606. (312) 899-0040. .

Национальная коалиция по заболеваниям пищеварительной системы (DDNC). 711 Second Street NE, Suite 200, Вашингтон, округ Колумбия, 20002. (202) 544-7497. .

Национальный информационный центр по заболеваниям пищеварительной системы, Национальный институт диабета, болезней органов пищеварения и почек и Национальные институты здравоохранения. 2 Information Way, Bethesda, MD 20892-3570. (310) 654-3810.

Джудит Симс

Ребекка Дж.Фрей, доктор философии

Роль ферментов поджелудочной железы в остром панкреатите

• М. В. Сингер
• П. Лайер
• Х. Гебелл

Доклад конференции

• 1 Цитаты
• 115 Загрузки

Abstract

Несмотря на обширные клинические и экспериментальные исследования, патофизиология острого панкреатита все еще плохо изучена.Хотя у 80% пациентов панкреатит связан с заболеванием желчевыводящих путей и злоупотреблением алкоголем, точные механизмы индукции и прогрессирования поражения поджелудочной железы остаются неясными. Имеются клинические и экспериментальные доказательства того, что интрапанкреатическая активация пищеварительных ферментов и последующее «самопереваривание» является общим патологическим процессом, лежащим в основе повреждения поджелудочной железы при остром панкреатите [4]. Однако одна из главных загадок этого заболевания остается без ответа, а именно: как и где в поджелудочной железе активируются пищеварительные ферменты при панкреатите? Мы все еще ищем пусковой механизм панкреатита.Кроме того, мы не знаем, вызваны ли сердечные, легочные и почечные осложнения во время острого панкреатита циркулирующими ферментами поджелудочной железы. С другой стороны, эти осложнения могут быть вызваны токсическими веществами, выделяемыми воспаленной поджелудочной железой, или просто быть неспецифической реакцией различных органов на сильное внутрибрюшное воспаление.

Ключевые слова

Острый панкреатит Протока поджелудочной железы Ацинарные клетки Панкреатический сок Фермент поджелудочной железы

Эти ключевые слова были добавлены машиной, а не авторами.Это экспериментальный процесс, и ключевые слова могут обновляться по мере улучшения алгоритма обучения.

Это предварительный просмотр содержимого подписки,

войдите в

, чтобы проверить доступ.

Предварительный просмотр

Невозможно отобразить предварительный просмотр. Скачать превью PDF.

Ссылки

1. 1.

   Adler G, Kern HF (1984) Тонкие структурные и биохимические исследования при остром панкреатите человека. В: Гир К.Е., Зингер М.В., Сарлес Х. (ред.) Панкреатит — концепции и классификация.Elsevier, Amsterdam

   Google Scholar

2. 2.

   Adler G, Arnold R, Kern HF (1984) Супрамаксимальная гормональная или нервная стимуляция — происходит ли это у людей? В: Гир К.Е., Зингер М.В., Сарлес Х. (ред.) Панкреатит — концепции и классификация. Эльзевир, Амстердам

   Google Scholar

3. 3.

   Аллан Б.Дж., Турнат Р., Уайт Т.Т. (1973) Внутрипротоковая активация зимогенов поджелудочной железы человека. N Engl J Med 288: 266

   PubMedGoogle Scholar

4. 4.

   Becker V (1980) Острый панкреатит — морфология, патогенез, прогноз. Chirurg 51: 357–363

   Google Scholar

5. 5.

   Creutzfeldt W, Schmidt H (1970) Этиология и патогенез панкреатита (современные концепции). Scand J Gastroenterol (Suppl) 6: 47–62

   Google Scholar

6. 6.

   Geokas MC, Rinderknecht H (1978) Свободные протеолитические ферменты в соке поджелудочной железы пациентов с острым панкреатитом. Am J Dig Dis 19: 591–598

   CrossRefGoogle Scholar

7. 7.

   Гиллиланд Л., Стир М.Л. (1980) Влияние этионина на синтез и выделение пищеварительных ферментов поджелудочной железой мышей. Am J Physiol 239: G418 – G426

   PubMedGoogle Scholar

8. 8.

   Hendricks JC, DiMagno EP, Go VLV, Dozois RR (1980) Рефлюкс дуоденального содержимого в проток поджелудочной железы собак. J Lab Clin Med 96: 912–921

   PubMedGoogle Scholar

9. 9.

   Hermon-Taylor J (1977) Этиологический и терапевтический обзор острого панкреатита.Br J Hosp Med 18: 546–552

   PubMedGoogle Scholar

10. 10.

    Kern HF, Adler G, Scheele GA (1984) Концепция потока и компартментации в понимании патобиологии панкреатита. В: Гир К.Е., Зингер М.В., Сарлес Х. (ред.) Панкреатит — концепции и классификация. Elsevier, Amsterdam

    Google Scholar

11. 11.

    Koike H, Steer ML, Meldolesi J (1982) Панкреатические эффекты этионина: блокада экзоцитоза и появление кринофагии предшествуют клеточному некрозу.Am J Physiol 242: G297 – G307

    PubMedGoogle Scholar

12. 12.

    Lampel M, Kern H (1977) Острый интерстициальный панкреатит у крыс, вызванный чрезмерными дозами панкреатического секретагогика. Virchows Arch Pathol Anat Histol 373: 97–117

    CrossRefGoogle Scholar

13. 13.

    McCutcheon AD (1968) Новый подход к патогенезу панкреатита. Gut 9: 296–310

    PubMedCrossRefGoogle Scholar

14. 14.

    Nevalainen TJ (1980) Роль фосфолипазы A в остром панкреатите.Scand J Gastroenterol 15: 641–650

    PubMedCrossRefGoogle Scholar

15. 15.

    Ofstad E (1970) Образование и разрушение кининов плазмы во время экспериментального острого геморрагического панкреатита у собак. Scand J Gastroenterol 5 Suppl 5: 1–44

    Google Scholar

16. 16.

    Owyang C, Dozois RR, DiMagno EP et al. (1977) Связь между постпрандиальным панкреатодуоденальным давлением, панкреатической секрецией и дуоденальным объемным кровотоком у собак.Гастроэнтерология 73: 1046

    PubMedGoogle Scholar

17. 17.

    Ranson JH (1984) Острый панкреатит: патогенез, исход и лечение. В: Creutzfeldt W (ed) Внешнесекреторная поджелудочная железа. Clin Gastroenterol 13: 843–864

    Google Scholar

18. 18.

    Рао К.Н., Тума Дж., Ломбарди Б. (1976) Острый геморрагический панкреатит у мышей. Интрапаренхиматозная активация зимогенов и другие изменения ферментов поджелудочной железы и сыворотки. Гастроэнтерология 70: 720–726

    PubMedGoogle Scholar

19. 19.

    Риндеркнехт Х., Реннер И.Г., Абрамсон С.Б., Кармак С. (1984) Мезотрипсин: новая резистентная к ингибиторам протеаза в ткани и жидкости поджелудочной железы человека. Гастроэнтерология 86: 681–692

    PubMedGoogle Scholar

20. 20.

    Schmidt H, Creutzfeldt W (1976) Этиология и патогенез панкреатита. В: Bockus HL (ed) Gastroenterology, 3-е изд. Saunders, London

    Google Scholar

21. 21.

    Steer ML, Meldolesi J (1984) Экспериментальный острый панкреатит.Актуальность моделей для клинического заболевания. В: Гир К.Е., Зингер М.В., Сарлес Х. (ред.) Панкреатит — концепции и классификация. Elsevier, Amsterdam

    Google Scholar

22. 22.

    Tykkä HT, Vaittinen EJ, Mahlberg KL, Railo JE, Pantzar PJ, Sarna S, Tallberg T (1985) Рандомизированное двойное слепое исследование с использованием CaNa2 EDTA, ингибитора фосфолипазы A2 в лечении острого панкреатита человека. Scand J Gastroenterol 20: 5–12

    PubMedCrossRefGoogle Scholar

Информация об авторских правах

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1986

Авторы и аффилированные лица

• M.V. Singer
• P. Layer
• H. Goebell
1. 1.Div. гастроэнтерологии, кафедра медицины, Эссен-Эссен, Германия

Сериновая протеаза, ферментный катализ | Изучите науку на Scitable

Allen, K. 2010 Acids and Bases. Nature Chemical Biology 6, июнь 2010 г. DOI: 10.1038 / nchembio.382.

Блоу, Д. М., Бирктофт, Дж. Дж. И др. Роль скрытой кислотной группы в механизме действия химотрипсина. Nature 221, 337–340 (1969). doi: 10.1038 / 221337a0

Бреннер, С. Молекулярная эволюция генов и белков: история двух серинов. Nature 334, 528–530 (1988). DOI: 10.1038 / 334528a0

Картер П. и Уэллс Дж. А. Рассечение каталитической триады сериновой протеазы. Nature 332, 564–568 (1988). DOI: 10.1038 / 332564a0

Craik, C. S., Largman, C. et al. Новый дизайн трипсина: изменение субстратной специфичности. Science 237, 291–297 (1985). DOI: 10.1126 / science.3838593

Delbaere, L. T. J., Hutcheon, W. L. B. et al. Третичные структурные различия между сериновыми протеазами микробов и сериновыми ферментами поджелудочной железы. Nature 257, 758–763 (1975). DOI: 10.1038 / 257758a0

Диксон, Г. Х. и Нейрат, Х. Biochimica et Biophysica Acta 20, 572–274 (1956).

Эрез, Э., Фасс, Д. и др. .Как внутримембранные протеазы скрывают гидролитические реакции в мембране. Nature 459, 371–378 (2009). DOI: 10.1038 / nature08146

Хартли Б. С. и Килби Б. А. Реакция п-нитрофениловых эфиров с химотрипсином и инсулином. Биохимический журнал 56, 288–297 (1954).

Кане, Д. и Стилл, У. С. Гидролиз пептидной связи в нейтральной воде. Журнал Американской химической ассоциации 110, 7529–7534 (1988).

Ноулз Дж. Ферментный катализ: не отличается, просто лучше. Nature 350 , 121–124 (1991). DOI: 10.1038 / 350121a0

Пуэнте, Х.С., Санчес, Л.М. и др. Протеазы человека и мыши: сравнительный геномный подход. Nature Reviews Genetics 4, 544–558 (2003). DOI: 10.1038 / nrg1111

Rawlings, N. D., Morton, F. R. et al. MEROPS: База данных протеаз. Nucleic Acids Research 36 Выпуск базы данных, D320–325 (2008) (по состоянию на 24 августа 2010 г.).

Rose, T. & Di Cera, E. Домашняя страница сериновой протеазы. (2000) (по состоянию на 24 августа 2010 г.).

Schoellmann, G. & Shaw E. Прямые доказательства присутствия гистидина в активном центре химотрипсина. Биохимия 2, 252–255 (1963). DOI: 10.1021 / bi00902a008

Stroud, R.M. Семейство ферментов, расщепляющих белок. Scientific American 231, 74–88 (1974).

Структура и функции химотрипсина

Структура и функции химотрипсина

Структура и функции химотрипсина

Учебное пособие, разработанное Россом Фельдбергом, отдел.биологии, Университет Тафтса

Справочная информация о химотрипсине

---

Химотрипсин имеет три цепи, связанные пятью дисульфидными связями
Цепи химотрипсина

Домены химотрипсина и вторичная структура
Бета-стволы и активный центр

Триада активных сайтов
Активный сайт

Триада активных сайтов со связанным ингибитором
Ингибитор, связанный с активным сайтом

Карман специфичности подложки
Как определяется специфичность?

---

---

Фон химотрипсина

Химотрипсин является членом семейства ферментов, все из которых расщепляют пептидные связи. через действие серина активного сайта (сериновые протеазы).В это семейство входят ферменты поджелудочной железы химотрипсин, трипсин и эластаза, а также множество других протеазы (например, коконаза, тромбин, акросомальная протеаза и т. д.). Химотрипсин, трипсин и эластазы демонстрируют высокую степень сходства в своей общей третичной структуре, но имеют разные специфичность субстрата определяется специфическим сайтом связывания субстрата на каждом ферменте. В Показанная здесь структура взята из файла pdb 1AFQ.pdb

Вернуться к руководству по химотрипсину

---

---

Химотрипсин состоит из трех цепей

Химотрипсин изначально синтезируется как неактивный предшественник из 245 аминокислот (зимоген). названный химотрипсиногеном.Активация химотрипсиногена включает протеолитическое расщепление на два сайта вдоль цепи и удаление двух аминокислот в каждом сайте расщепления. Результирующий Здесь показаны три цепочки (цепочка 1 = 1-13 зеленым; цепочка 2 = 16-146 красным; цепочка 3 = 149-24 синим цветом). Обратите внимание, что некоторые аминокислоты на концах этих цепей не показаны в цифрах. представление (например, 11-13, 149,). Это потому, что эти остатки проявляют слишком большую гибкость. в кристаллических структурах, чтобы получить картины дифракции рентгеновских лучей, которые позволили бы определить их местонахождение в пространстве.

Три цепи скреплены пятью дисульфидными связями. Можете ли вы определить конкретный остатки cys, связанные каждой дисульфидной связью? Почему так сложно получить активный химотрипсин после денатурации и ренатурации? Использование пунктов меню звукового сигнала Выберите — Действие щелчка мышью — Расстояние, определите расстояние между пептидными остовами, когда образуются дисульфидные связи. Как это соотносится с типичным расстоянием водородных связей?

Воспроизвести анимацию
Вернуться к руководству по химотрипсину

---

---

Бета-бочки, белковые домены и активный центр

Общая молекула химотрипсина складывается в два домена, каждый из которых содержит шесть бета пряди, расположенные в виде антипараллельных листов, которые образуют круговую структуру, известную как бета бочка.(вращайте молекулу, пока не смотрите сквозь ствол или под прямым углом к бочке). Остатки активного сайта (ser-195, his-57 и ser-102 показаны здесь как заполнение пространства) далеко друг от друга в первичной последовательности, но собраны вместе в щели формируется между двумя белковыми доменами.

Воспроизвести анимацию
Вернуться к руководству по химотрипсину

---

---

Триада активных сайтов

Активный центр химотрипсина состоит из asp102, расположенного рядом с его 57 и ser 195.Точный механизм действия все еще обсуждается, но похоже, что водород на его имидазольное кольцо переносится на карбоксилат asp 102 (либо через «систему реле заряда») или через «водородную связь с низким барьером»). Этот сдвиг приводит к тому, что гистидиновое кольцо способно принимать гидроксил-водород серина195, образующий очень нуклеофильный алкоксид-ион серина.

Воспроизвести анимацию
Вернуться к руководству по химотрипсину

---

---

Связывание субстрата

Эта структура содержит конкурентный ингибитор, D-лейцил-L-фенилаланил-p- фторбензиламид.Фторбензиламидная группа является ароматической и связана со специфичностью карман (см. следующую кнопку). В реальном субстрате связь разорвана с карбоксильной группой. сторона ароматической аминокислоты. В этом ингибиторе есть два остатка на амидной стороне, но не осталось остатков на стороне карбоксила. Таким образом, нет расщепляемой связи. в этой структуре.

Воспроизвести анимацию
Вернуться к руководству по хирмотрипсину

---

---

Активная среда сайта

Конкретный карман, примыкающий к триаде активных центров, определяет специфичность протеазы. (химотрипсин расщепляет прилегающие большие ароматические боковые цепи, трипсин прилегает к lys или arg остатки).Остатки, составляющие этот карман, показаны желтым, а три остатка которые являются преобладающими детерминантами этой специфичности, показаны как заполнение пространства. Это амино- кислоты 189, 216 и 226, которые выстилают карман, прилегающий к триаде активных центров. В трипсине и остатки химотрипсина 216 и 226 оба являются глицином, так что объемные боковые цепи в субстрат может выходить внутрь этого кармана. Напротив, в эластазе эти остатки являются val и th, так что громоздкие группы R не помещаются в этот карман.В химотрипсине остаток 189 представляет собой серин, и это позволяет объемным ароматическим R-группам взаимодействовать с карманом. преимущественно через силы Ван-дер-Ваальса. В трипсине остаток 189 — это asp, что позволяет связывание положительно заряженных lys или arg.

Воспроизвести эту анимацию

Интересно, что это знание не позволило нам манипулировать этим белком так легко, как мы. предсказано. Например, на основе этой структуры было предсказано, что мутация трипсина такой ген, что asp189 был заменен лизином, должен давать фермент, специфичный для расщепления пептиды, примыкающие к кислотным группам.Однако когда был проведен эксперимент, было обнаружили, что этот новый фермент неактивен с субстратами, содержащими asp или glu, но более активен с лейсодержащими субстратами. Вероятно, что замена одной аминокислоты может нарушить складку и структуру в целом непредвиденным образом.
Вернуться к руководству по химотрипсину

---

Это руководство было разработано Россом С. Фельдбергом (Департамент биологии, Тафтс) с помощь гранта Teaching with Technology от Центра передового опыта в области преподавания Пучки.
Любые исправления или комментарии следует отправлять по адресу [email protected].

.