Диабетическая ретинопатия мкб: Диабетическая ретинопатия > Клинические протоколы МЗ РК

Патогенетическая роль С-реактивного белка человека при диабетической ретинопатии | Клиническая наука

Диабетическая ретинопатия (ДР) — основная причина потери зрения у людей трудоспособного возраста в развитых странах [1]. Непролиферативная DR (NPDR) проявляется прогрессирующей адгезией лейкоцитов в сетчатке, дегенерацией нейронов сетчатки, дегенерацией капилляров и утечкой сосудов сетчатки [2,3].Без надлежащего лечения DR может прогрессировать до своей продвинутой стадии, пролиферативной DR (PDR), характеризующейся патологическим ангиогенезом в сетчатке [4]. Накапливающиеся данные продемонстрировали, что нарушение нервно-сосудистой системы из-за повышенного окислительного стресса и воспаления в сетчатке играет ключевую роль в DR [5-7].

C-реактивный белок (CRP) является прототипом белка острой фазы и преимущественно экспрессируется в гепатоцитах в ответ на инфекцию, воспаление или повреждение тканей [8].Предыдущие исследования показали, что CRP чрезмерно продуцируется у пациентов с диабетом как 1-го, так и 2-го типа [9,10]. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что высокие уровни CRP связаны с риском диабетических микрососудистых осложнений, таких как нефропатия, нейропатия и ретинопатия [11–13]. Во время базового посещения исследования по контролю диабета и его осложнений (DCCT) участники с DR показали значительно более высокие уровни CRP в сыворотке по сравнению с участниками без ретинопатии [11]. Кроме того, еще два исследования продемонстрировали более высокие уровни СРБ в сыворотке у пациентов с PDR по сравнению с пациентами с NPDR [12,13].Эти эпидемиологические исследования показали, что СРБ можно использовать в качестве биомаркера диабетических осложнений. Однако основной механизм положительной связи между CRP и диабетическими осложнениями, особенно DR, остается неизвестным.

Сообщалось, что CRP вызывает образование активных форм кислорода (ROS) и воспаление за счет связывания с рецепторами Fcγ, включая рецептор Fcγ I (CD64) и рецептор Fcγ II (CD32) [14–16].CRP может активировать сигнальный путь NF-κB, что приводит к образованию ROS и усилению регуляции провоспалительных факторов, таких как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), и молекул клеточной адгезии, таких как молекула межклеточной адгезии. 1 (ICAM-1) [17]. Лю и др. сообщили, что повышенные уровни CRP у трансгенных мышей CRP способствовали воспалению и фиброзу в почках в контексте диабета [18]. Кроме того, недавнее исследование показало, что CRP оказывает сильное ангиогенное действие на эндотелиальные клетки микрососудов [19].Кроме того, есть доказательства того, что CRP играет роль в процессе апоптоза [20]. Хотя CRP был указан как медиатор заболевания в неглазных тканях, патогенная роль CRP в DR остается неизвестной.

В настоящем исследовании мы проверили гипотезу о том, что повышенные уровни СРБ могут способствовать нервно-сосудистым нарушениям при ДР за счет увеличения окислительного стресса и воспаления сетчатки. Чтобы исследовать патогенную роль CRP в контексте DR, мы использовали индуцированную стрептозотоцином (STZ) модель диабета 1 типа на крысах с трансгенным CRP человека (hCRP-Tg).Для дальнейшего изучения роли CRP в неоваскуляризации сетчатки (NV) и воспалении мы использовали крысиную модель кислород-индуцированной ретинопатии (OIR). Мы также измерили CRP-индуцированный окислительный стресс и апоптоз в иммортализованных клетках Мюллера сетчатки крысы (rMC-1) и клетках-предшественниках сетчатки мыши (661W) in vitro .

Для срезов, залитых парафином, из глазных яблок крыс удаляли ядра и фиксировали в фиксаторе Дэвидсона на 48 часов.Глазные яблоки заливали парафином и вырезали срезы размером 5 мкм. Депарафинизация и поиск антигена выполнялись, как описано ранее [31]. Срезы иммуноокрашивали антителами к 3-нитротирозину (3-NT, Abcam, Cambridge, MA), CD32, человеческому CRP и родопсину (1D4, Abcam, Cambridge, MA). Срезы глазного яблока окрашивали агглютинином арахиса (PNA; Vector Laboratories, Burlingame, CA) для мечения клеток колбочек. Для окрашивания TUNEL слайды срезов инкубировали в реакционной смеси TUNEL, содержащей фермент и раствор метки, в течение 1 часа при 37 ° C в темноте в соответствии с протоколами набора In situ Cell Death Kit (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). .Кроме того, срез сетчатки, обработанный ДНКазой1, использовали в качестве положительного контроля окрашивания TUNEL. Слайды были закреплены с установочным буфером, содержащим DAPI (синий), а затем сфотографированы с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (FV1000) (Olympus, PA, США). Для количественной оценки интенсивность 3-NT измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ (Bethesda, MD, США) в соответствии с документированным протоколом [32]. Вкратце, была выбрана вся площадь разреза сетчатки. Затем в выбранных областях было измерено «среднее значение серого».Значения были нормализованы к среднему значению для крыс WT без диабета. Для подсчета TUNEL-положительных клеток или нейронных клеток сетчатки подсчет клеток производился в трех случайных полях в центральных областях (от непосредственно прилегающих к зрительному нерву до приблизительно 1000 мкм от зрительного нерва) как в верхнем, так и в нижнем направлениях в каждом срезе сетчатки. . В каждой группе для анализа использовали как минимум шесть срезов сетчатки, взятых у шести разных крыс.

Чтобы оценить влияние высоких уровней чСРБ на функцию сетчатки в условиях диабета, у крыс WT и крыс чСРБ-Tg в возрасте 2 месяцев индуцировали диабет.Чтобы исключить возможное влияние диабета на экспрессию hCRP, уровни hCRP в сетчатке измеряли с помощью вестерн-блоттинга у недиабетических крыс hCRP-Tg и крыс с диабетом hCRP-Tg. Не было значительной разницы в уровнях hCRP у крыс с STZ-индуцированным диабетом hCRP-Tg по сравнению с таковыми у недиабетических крыс hCRP-Tg (дополнительная фигура S5A, B). Скотопическая ЭРГ регистрировалась через 1, 4 и 7 месяцев после начала диабета. Через 1 месяц после начала диабета у диабетических крыс hCRP-Tg не наблюдалось значительного снижения скотопической волны a и b по сравнению с крысами с диабетом WT (рис. 4A, B).Однако у диабетических крыс hCRP-Tg наблюдалось значительное снижение скотопической волны a и b по сравнению с крысами с диабетом WT через 4 и 7 месяцев диабета (рис. 4A, B). Кроме того, неявное время скотопической волны a и b регистрировалось и анализировалось у 6-месячных крыс. Не наблюдалось значительного увеличения неявного времени скотопической волны a и b у недиабетических или диабетических крыс hCRP-Tg по сравнению с таковыми у крыс WT (дополнительный рисунок S2C, D). Чтобы определить, связано ли прогрессирующее снижение функции сетчатки с повышенной гибелью клеток сетчатки у крыс с диабетом hCRP-Tg, мы измерили апоптоз в сетчатке.Согласно измерениям с помощью TUNEL, наблюдалось увеличение количества TUNEL-положительных клеток в сетчатке у диабетических hCRP-Tg крыс по сравнению с таковыми у диабетических крыс WT (рис. 4C). Сетчатка крыс с диабетом hCRP-Tg показала примерно двукратное увеличение TUNEL-положительных клеток по сравнению с таковыми у диабетических крыс WT (рис. 4D). Аналогичным образом, ELISA клеточной смерти продемонстрировал, что количество апоптозных клеток сетчатки увеличивалось примерно в 1,5 раза у диабетических крыс hCRP-Tg по сравнению с диабетическими крысами WT (фиг. 4E). Чтобы идентифицировать типы клеток, которые были затронуты дегенерацией сетчатки, была количественно определена плотность фоторецепторных клеток сетчатки.Родопсин и ПНК использовали в качестве маркеров для маркировки наружных сегментов палочек и фоторецепторов колбочки соответственно [40,41]. Наблюдалось значительное снижение интенсивности окрашивания родопсином у диабетических крыс hCRP-Tg по сравнению с диабетическими крысами WT (дополнительный рисунок S7A, B). Наблюдалось значительное снижение плотности PNA-положительных клеток у диабетических hCRP-Tg крыс по сравнению с диабетическими крысами WT (дополнительный рисунок S8A, B). Эти результаты показали, что чСРБ способствует дегенерации фоторецепторов сетчатки.

CRP является общепризнанным биомаркером острого воспаления, а также связан с хроническим воспалением низкой степени и нейродегенеративными заболеваниями [42].Проспективные клинические исследования продемонстрировали положительную корреляцию между повышенными уровнями СРБ и диабетом 1 и 2 типа, а также повышенным риском диабетических осложнений, таких как DR [9–11]. Однако патогенная роль CRP в DR никогда не исследовалась. Настоящее исследование предоставляет доказательства того, что повышенные уровни чСРБ приводят к дисфункции сетчатки, вызывая нейральную дегенерацию сетчатки в недиабетических условиях. В условиях диабета повышенный уровень чСРБ усугубляет дисфункцию сетчатки, нервную дегенерацию, воспаление и сосудистую дисфункцию.hCRP также усиливал вызванную ишемией NV сетчатки в модели OIR. Что касается механизма роли CRP в патогенезе DR, мы обнаружили, что hCRP индуцировал избыточную продукцию ROS и сверхэкспрессию провоспалительных факторов в недиабетических условиях, диабетических состояниях и в модели OIR, вероятно, через CD32 / NF- Передача сигналов κB, которая отвечает, по крайней мере, частично за hCRP-индуцированный апоптоз клеток сетчатки и последующую дисфункцию сетчатки. В совокупности наше исследование показало, что повышенный уровень чСРБ при диабете является новым патогенетическим механизмом и потенциальной терапевтической мишенью для DR.

Нормальный диапазон сывороточного СРБ у здоровых взрослых колеблется от 0,8 до 3,0 мг / л, как измерено общепринятым высокочувствительным иммуноанализом [43]. Laursen et al. сообщили, что 90-й процентиль сывороточного СРБ составлял 21,4 мг / л у пациентов с диабетом 1 типа с ретинопатией [44]. Наша модель трансгенных крыс показала, что средние сывороточные уровни чСРБ составляли от 28,5 мг / л у крыс чСРБ-Tg в возрасте 3 месяцев, что позволяет предположить, что уровни чСРБ в этой модели физиологически релевантны для пациентов с диабетом.Более того, STZ-индуцированный диабет не изменил уровни hCRP в сетчатке у крыс hCRP-Tg, что указывает на то, что наши трансгенные крысы являются подходящей моделью для специфического исследования роли hCRP при диабете. Кроме того, в отличие от hCRP, эндогенный CRP крысы (rCRP) не является белком острой фазы, который не способен активировать комплемент [45–47]. Таким образом, мы применили эту трансгенную модель со сверхэкспрессией чСРБ.

DR был традиционно известен как сосудистое осложнение сетчатки [48].Однако более поздние исследования показали, что дегенерация нейронов сетчатки также играет роль в потере зрения у пациентов с ДР [5,49]. Настоящее исследование продемонстрировало, что высокие уровни чСРБ вызывают снижение а-волны и b-волны ERG, усиление апоптоза в сетчатке и уменьшение толщины сетчатки при недиабетическом состоянии, предполагая, что сверхэкспрессия чСРБ сама по себе может вызывать нейродегенерацию сетчатки. Для дальнейшей идентификации прямого действия чСРБ на клетки сетчатки мы применили очищенный чСРБ к культивируемым клеточным линиям, полученным из клеток Мюллера сетчатки и из фоторецепторных клеток.Результаты показали, что чСРБ индуцировал апоптоз в этих культивируемых клетках сетчатки. Эти результаты in vivo, и in vitro, подтвердили, что hCRP непосредственно действует на клетки сетчатки и индуцирует апоптотическую гибель клеток. Здесь мы впервые показали, что чСРБ участвует в проапоптотическом эффекте при глазных расстройствах, что согласуется с предыдущими данными о сердечно-сосудистой системе и иммунной системе [14,20,50]. Ryu et al. описали апоптотические изменения гладкомышечных клеток сосудов в ответ на чСРБ [14].Кроме того, Kim et al. сообщили, что чСРБ стимулировал апоптоз, вызывая остановку фазы G ₂ / M в клеточном цикле в моноцитах [37].

Чтобы изучить влияние повышенных уровней hCRP на нейроны сетчатки и сосудистую сеть при диабете, мы индуцировали диабет у крыс WT и крыс hCRP-Tg. Как продемонстрировано окрашиванием TUNEL, большинство апоптотических клеток располагалось в ONL, что указывает на ускорение чСРБ гибели фоторецепторов сетчатки при диабете.Мы подтвердили это наблюдение путем количественного определения фоторецепторных клеток палочки и колбочки. Мы обнаружили, что чСРБ способствует вызванной диабетом потере фоторецепторов сетчатки. Это наблюдение можно объяснить более интенсивной экспрессией hCRP и CD32 в слое внешних сегментов фоторецепторов (POS), что может опосредовать прямой вредный эффект в фоторецепторных клетках. Более того, фоторецепторы генерируют высокие уровни АФК, и они также очень уязвимы к окислительному стрессу [2]. чСРБ в локальном микроокружении может ухудшить апоптоз фоторецепторов, вызванный окислительным стрессом в условиях диабета.Между тем, мы также наблюдали, что чСРБ усугубляет воспаление сосудов сетчатки и гибель сосудистых клеток при диабете. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия чСРБ приводит к большему количеству лейкоцитов, прикрепленных к сосудистой сети сетчатки, и большему количеству бесклеточных капилляров в сетчатке при диабете. Учитывая высокий уровень чСРБ в кровообращении и интенсивную экспрессию рецептора СРБ, CD32, в сосудистой сети сетчатки, чСРБ может ускорять вызванное диабетом повреждение сосудов сетчатки посредством CD32. Эти данные свидетельствуют о том, что повышенные уровни чСРБ при диабете усугубляют индуцированное диабетом воспаление сетчатки, дегенерацию нейронов и повреждение сосудов.

Модель OIR, одна из общепринятых моделей NV сетчатки, вызванная ишемией, была использована для исследования патогенной роли hCRP в NV сетчатки. В модели OIR высокие уровни hCRP усиливали вызванную ишемией NV сетчатки. Интересно, что повышенный чСРБ может увеличивать неперфузионную область в сетчатке щенков, подвергшихся гипероксическим условиям, а также способствовать более позднему образованию патологических сосудов в относительно гипоксической среде.Предположительно, это может быть результатом более тяжелой вазо-облитерации у детенышей чСРБ-Tg, вероятно, в результате более тяжелого лейкостаза. В соответствии с этим, мы наблюдали усиление индуцированной ишемией сверхэкспрессии VEGF в сетчатке щенков hCRP-Tg с OIR. Этот проангиогенный эффект чСРБ согласовывался с предыдущим исследованием, в котором сообщалось о повышенном уровне VEGF в кондиционированной среде стволовых клеток, полученных из жировой ткани, обработанных СРБ, что приводило к увеличению образования трубок в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). ) [51].Однако некоторые авторы наблюдали, что hCRP ингибирует продукцию VEGF и ангиогенез в неокулярных тканях [52,53]. Несоответствие роли hCRP в ангиогенезе предполагает, что CRP может играть разные роли в разных условиях.

Существует три потенциальных механизма патогенной роли hCRP в DR. Во-первых, мы обнаружили, что повышенные уровни чСРБ повышают экспрессию провоспалительных факторов как в физиологических, так и в патологических состояниях, включая диабетическое состояние и гипоксическое состояние в модели OIR.Однако у крыс hCRP-Tg наблюдалось значительное увеличение лейкостаза сетчатки только при патологическом состоянии, что позволяет предположить, что повышенный hCRP может играть пагубную роль в индуцированном высоким уровнем глюкозы или гипоксии повышении регуляции провоспалительных цитокинов в сетчатке. Во-вторых, чСРБ может способствовать окислительному стрессу, вызванному диабетом. Иммуноокрашивание 3-NT продемонстрировало усиление сигналов 3-NT в срезах сетчатки диабетических крыс hCRP-Tg по сравнению с диабетическими крысами WT, подтверждая, что hCRP приводил к более тяжелому окислительному стрессу в сетчатке.В-третьих, чСРБ может способствовать DR за счет усиления NV сетчатки. Как известно, гипергликемия и метаболические нарушения при диабете приводят к изменениям сосудистой сети сетчатки, что приводит к относительной гипоксии сетчатки [54]. Среди различных ангиогенных факторов VEGF играет ключевую роль в индуцированной ишемией NV при DR. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия hCRP может повышать уровень VEGF в сетчатке модели OIR. Повышенный уровень VEGF в hCRP-Tg модели OIR может происходить косвенно в результате повышенной вазо-облитерации.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что вызванное hCRP воспаление, окислительный стресс и ангиогенез могут вносить вклад в повреждение нервно-сосудистой единицы сетчатки в условиях диабета.

Чтобы исследовать сигнальный путь, лежащий в основе патологического изменения, вызванного чСРБ, мы сначала измерили в сетчатке уровни рецептора чСРБ, CD32. Предыдущие исследования идентифицировали CD32 как главный рецептор CRP в различных тканях.Du Clos et al. идентифицировали CD32 как главный рецептор CRP в моноцитах и ​​нейтрофилах на основе взаимодействия между CRP и клетками, трансфицированными CD32, с помощью проточной цитометрии [20,55]. Более того, было показано, что CD32 является одним из рецепторов CRP в эндотелиальных клетках аорты человека (НАЭК) и эпителиальных клетках почечных канальцев с использованием нейтрализующих антител к CD32 [18,56]. Кроме того, эндотелиальные клетки, обработанные CRP, и почки мышей hCRP-Tg показали повышенную регуляцию CD32 [18,56]. Наши результаты впервые продемонстрировали, что сверхэкспрессия hCRP была связана с повышающей регуляцией CD32 в сетчатке.Это согласуется с данными по неглазным тканям. Во-вторых, поскольку путь NF-κB был ниже CD32, а аберрантная активация пути NF-κB приводила к усилению регуляции провоспалительных факторов, мы проверили, был ли индуцированный hCRP патогенез DR ассоциирован с повышением регуляции этот сигнальный путь [57,58]. Наши результаты продемонстрировали, что сверхэкспрессия hCRP приводит к активации пути NF-κB, что может дополнительно усиливать воспаление, генерацию АФК и NV.Эти патологические изменения могут способствовать апоптотической гибели клеток сетчатки, что приводит к дегенерации сетчатки и нарушению зрительной функции. Это мнение было подтверждено наблюдениями, опубликованными в предыдущих исследованиях [18,57,59,60]. Более того, поскольку путь Wnt также является хорошо принятой провоспалительной передачей сигналов при DR [61], мы также изучили перекрестные помехи между передачей сигналов hCRP и Wnt. Однако мы обнаружили, что чСРБ не усиливает активацию пути Wnt на основании анализа транскрипционной активности β-катенина на основе люциферазы или анализа вестерн-блоттинга уровней β-катенина, что позволяет предположить, что эффект чСРБ вряд ли опосредуется передачей сигналов Wnt.Взятые вместе, эти результаты показали, что hCRP вызывает воспаление и NV, по крайней мере частично, посредством передачи сигналов NF-κB.

У нашего исследования есть несколько ограничений. Во-первых, мы только проверили роль hCRP в патогенезе DR на модели диабета 1 типа. Вопрос о том, играет ли чСРБ патогенную роль в DR диабета 2 типа, требует дальнейшего изучения. Во-вторых, повышенный уровень циркуляции чСРБ может вызвать системный воспалительный эффект, который может привести к вторичным патологическим изменениям в тканях глаза.В-третьих, чСРБ может управлять воспалением через несколько сигнальных путей. Мы не можем исключить потенциальные пути передачи сигналов в дополнение к передаче сигналов NF-κB.

Таким образом, наше исследование впервые показало, что чСРБ является не только биомаркером, но и патогенным фактором DR. hCRP повреждает нервно-сосудистую единицу сетчатки, по крайней мере, частично, способствуя воспалению, генерации ROS и NV в сетчатке. Настоящее исследование предполагает, что активируемый путь hCRP-CD32-NF-κB может представлять новый патогенетический механизм для DR и что hCRP может быть потенциальной терапевтической мишенью для DR.

Потеря X-box-связывающего белка 1 в клетках Мюллера усиливает воспаление сетчатки на мышиной модели диабета

Животные

MG-специфичных Xbp1 -нокаут ( Xbp1 ^{Müller — / —} ) мышей на фоне C57BL / 6J получали путем скрещивания «флоксованных» мышей Xbp1 , несущих сайты loxP вокруг экзона 2 Xbp ] с трансгенными мышами, специфичными для MG, которые экспрессируют рекомбиназу Cre в клетках Мюллера [25], в Центре медицинских наук Университета Оклахомы (OUHSC, Оклахома-Сити, Оклахома, США).Cre-рекомбиназа отрицательные, Xbp1 flox / flox ( Xbp1 ^{Müller + / +} ) однопометников использовали в качестве контроля дикого типа во всех экспериментах. Уход, использование и лечение всех животных в этом исследовании были в строгом соответствии с Положением об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии, а также с руководящими принципами, изложенными в Университете Буффало. и OUHSC. Чтобы вызвать диабет, 8-недельных мышей-самцов случайным образом распределили для получения пяти последовательных i.п. инъекции стрептозотоцина (50 мг / кг массы тела / день; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США, растворенного в 0,01 моль / л цитратного буфера, pH 4,5) или носителя (0,01 моль / л цитратного буфера, pH 4,5) в виде контроль. Впоследствии, через 8 недель после инъекции стрептозотоцина, мышей гуманно умерщвляли, а их глаза собирали для анализа.

Первичная культура клеток Мюллера и характеристика

Мышей в возрасте 7-10 дней использовали для первичных культур клеток Мюллера в соответствии с протоколом, описанным в другом месте [25].Клетки третьего пассажа высевали на покровные стекла, предварительно покрытые поли-1-лизином и ламинином (Sigma-Aldrich), и выращивали в течение ночи. Затем клетки фиксировали холодным ацетоном и иммуноокрашивали путем инкубации с мышиным антителом к ​​глутамин синтетазе (разведение 1: 100; Millipore, Billerica, MA, USA) в течение ночи при 4 ° C с последующим введением вторичного антитела, конъюгированного с Cy3. Флуоресценцию визуализировали с помощью микроскопа AX70 (Olympus, Токио, Япония).

Плоское крепление сетчатки мыши и окрашивание кровеносных сосудов

Глобусы мышей энуклеировали и тщательно вырезали сетчатку.Сетчатку блокировали блокирующим буфером (1 × PBS с 3% (об. / Об.) Нормальной ослиной сывороткой и 0,3% (об. / Об.) Triton X-100), а затем инкубировали с изолектином GS-IB4 (1: 200; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в течение 48 ч при 4 ° C. Затем сетчатку промывали 1 × PBS и помещали на предметные стекла для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Электроретинография

Функцию сетчатки у мышей оценивали электроретинографией (ERG) на мышах дикого типа с помощью системы Espion E2 (Diagnosys, Lowell, MA, USA).Вкратце, мышей адаптировали к темноте в течение ночи, и их зрачки были расширены с помощью 1% атропина и 1% циклопентолата перед ERG. После введения анестезии два платиновых записывающих электрода помещали на роговицу, причем электрод сравнения находился во рту, а заземляющий электрод — на хвосте. Были использованы две интенсивности вспышки: 1000 и 2000 кд / м ² . Для сравнения функции сетчатки регистрировали и усредняли амплитуды a-волны и b-волны скотопических и фотопических ЭРГ [27].

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали из сетчатки мыши с использованием TRIzol (Invitrogen) и подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием случайных гексамеров и системы синтеза первой цепи SuperScript III (Invitrogen). Количественную ОТ-ПЦР в реальном времени выполняли с использованием основной смеси SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя и праймеров, перечисленных в таблице 1 ESM. Для каждого исследованного гена отбирали образцы. выполняли в трех повторностях, и среднее значение C _t нормализовали по отношению к C _t для 18S рРНК, чтобы получить логарифмическое преобразованное значение ₂ для уровней экспрессии гена.

Вестерн-блоттинг

Сетчатку и клетки лизировали в буфере для анализа радиоиммунной преципитации со смесью ингибиторов протеаз, фенилметилсульфонилфторидом и ортованадатом натрия (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США). Смеси белков (25 мкг на лунку) разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны, которые зондировали мышиными анти-TNF-α, анти-VEGF, анти-фосфо-JNK (фосфорилированной N-концевой киназой c-Jun; p -JNK) и анти-HIF1-α (индуцируемый гипоксией фактор транскрипции 1α) антитела, кроличьи анти-ATF4 (активирующий фактор транскрипции 4; эти антитела были получены от Santa Cruz Biotechnology и использовались в разведении 1: 200), кроличьи анти-GRP78 (78 кДа глюкозо-регулируемый белок; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США; 1: 2000), антифосфо-eIF2α (фосфорилированный эукариотический фактор инициации трансляции 2α; p-eIF2α; Cell Signaling, Technology, Данверс, Массачусетс, США; 1 : 1000) и анти-ATF6 (Abcam; 1: 1000).Каждую мембрану удаляли и повторно наносили мышиное антитело против β-актина (Abcam; 1: 10 000), чтобы продемонстрировать аналогичные уровни контрольного β-актина на каждой дорожке. Антитела были подтверждены с использованием положительного и отрицательного контролей.

Анализ сосудистой проницаемости сетчатки

Проницаемость сосудов сетчатки определяли количественно, как описано ранее [11]. Мышам подвергали глубокую анестезию и внутрижелудочковую инъекцию декстрана, конъюгированного с FITC (4.4 кДа; Sigma) в дозе 50 мг / кг массы тела. Через 15 мин открывали грудную полость, отбирали образец крови из желудочка и сосуды перфузировали PBS (500 мл / кг массы тела). Сетчатку осторожно препарировали, взвешивали и гомогенизировали, и FITC – декстран из гомогената сетчатки экстрагировали центрифугированием. Флуоресценцию в образцах сетчатки и плазмы измеряли с помощью спектрофлуориметра с возбуждением на 485 нм и эмиссией на 538 нм, а проницаемость рассчитывали по следующему уравнению:

$$ \ frac {\ mathrm {Retinal} \ \ mathrm {FITC } \ hbox {-} \ mathrm {dextran} \ \ left (\ upmu \ mathrm {g} \ right) / \ mathrm {retinal} \ \ mathrm {weight} \ \ left (\ mathrm {g} \ right) } {\ mathrm {Plasma} \ \ mathrm {FITC} \ hbox {-} \ mathrm {dextran} \ \ mathrm {концентрация} \ left (\ upmu \ mathrm {g} / \ upmu \ mathrm {l} \ справа) \ times \ mathrm {обращение} \ \ mathrm {время} \ \ left (\ mathrm {h} \ right)} $$

Иммуногистохимия для криосрезов и культивированных первичных клеток Мюллера

Глобусы мыши фиксировали 4% (вес / об.) параформальдегид, а срезы получали с помощью криостата. Культивируемые первичные клетки Мюллера фиксировали холодным ацетоном. Срезы сетчатки иммуноокрашивали путем инкубации с кроличьими анти-GRP78 (1: 600), кроличьими анти-p-eIF2α (1: 100), мышиными анти-VEGF (1: 100), мышиными анти-TNF-α (Santa Cruz Biotechnology; 1: 100), кроличьи антитела против ATF6 (Abcam; 1: 100) или мышиные антитела против глутаминсинтетазы (EMD Millipore, 1: 100) в течение ночи при 4 ° C с последующей инкубацией с Cy3-конъюгированными или биотинилированными вторичными антителами в комнате. температура в течение 90 мин.Антитела были подтверждены с использованием положительного и отрицательного контролей. Флуоресценцию визуализировали с помощью микроскопа Olympus AX70. Относительную интенсивность флуоресценции VEGF или TNF-α в клетках Мюллера определяли количественно без учета обработки или генотипа в пяти случайных областях на каждом изображении с использованием программного обеспечения NIH ImageJ и нормализовали к общему количеству клеток. Для статистического анализа использовались данные трех изображений на группу.

Статистический анализ

Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение не менее трех независимых экспериментов.Статистическую значимость среди трех или более групп определяли односторонним дисперсионным анализом с тестом множественного сравнения Бонферрони или Тьюки. Статистическая значимость между двумя группами определялась с помощью непарного теста Стьюдента t . Значения вероятности p <0,05 считались указанием на значительную разницу.

Воспалительные и ангиогенные биомаркеры при диабетической ретинопатии

Введение

Диабетическая ретинопатия (ДР) — одно из наиболее частых микрососудистых осложнений сахарного диабета (СД) и ведущая причина нарушения зрения и предотвратимой слепоты у взрослых трудоспособного возраста в развитых странах ( 1 ).Он характеризуется возникновением микроаневризм, повышенной проницаемостью сосудов, закупоркой капилляров, фиброзной и неоваскулярной пролиферацией. Диабетическую ретинопатию можно разделить на легкую, среднюю и тяжелую непролиферативную DR (NPDR) и пролиферативную DR (PDR). На любой стадии из-за повышенной проницаемости сосудов и накопления внутри- и внеклеточной жидкости в макуле может появиться диабетический макулярный отек (ДМО) ( 2 ). Общая распространенность любой формы ДР в период с 2015 по 2019 год оценивалась в 27%, включая 25.2% с NPDR, 1,4% с PDR и 4,6% с DME ( 1 ). После 20 лет продолжительности диабета почти у всех пациентов с диабетом 1 типа и более чем у 60% пациентов с диабетом 2 типа развилась какая-либо форма ретинопатии ( 3 ). Основными факторами риска развития ДР являются гипергликемия, гипертония, дислипидемия, ожирение, апноэ во сне, беременность, продолжительность СД, курение и генетические факторы ( 4 — 10 ). В патогенез ДР участвуют различные биохимические пути, несмотря на интенсивные исследования; он все еще не полностью изучен ( 9 ).Согласно текущим исследованиям, ДР рассматривается как нейродегенеративное, воспалительное и микрососудистое осложнение диабета ( 9 , 10 ). Вклад воспалительных процессов и ангиогенеза в структурные и молекулярные изменения, связанные с DR, привлекает все большее внимание и стал предметом многих исследований ( 10 — 15 ).

Основная цель лечения ДР, включая лазерную фотокоагуляцию, интравитреальные фармакологические препараты и хирургию стекловидного тела, — улучшить или защитить зрение ( 7 ).Наиболее предпочтительным методом является внутриглазная фармакотерапия, в частности, применение ингибиторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) ( 5 , 10 , 12 ). Существующие методы лечения ДР применяются преимущественно на поздних стадиях заболевания и могут быть связаны с серьезными побочными эффектами. На ранних стадиях единственным доступным терапевтическим подходом является строгий контроль изменяемых факторов риска ДР, особенно гликемии, артериального давления и регуляции концентрации липидов в сыворотке.Следовательно, необходимы новые методы диагностики для выявления начальных стадий этого диабетического осложнения и мониторинга эффектов применяемой терапии ( 5 , 11 , 14 , 15 ). Циркулирующие биомаркеры могут быть ценным инструментом для выявления ранних стадий DR, выявления пациентов, наиболее подверженных его прогрессированию, и мониторинга реакции на применяемое лечение ( 4 , 11 , 14 — 17 ).

Обширные исследования подтвердили роль воспаления и ангиогенеза в патогенезе DR ( 4 — 6 , 9 — 15 , 18 ).Изменения концентраций различных провоспалительных и ангиогенных медиаторов были обнаружены в сыворотке крови, водянистой влаге (AH), стекловидном теле, сетчатке и слезах пациентов с DR. Их концентрации часто коррелируют со степенью DR, подразумевая, что они могут использоваться в качестве биомаркеров ( 9 , 10 , 12 — 14 , 19 — 39 ). Учитывая, что ряд этих молекул участвует в формировании и развитии DR, в этот обзор мы включили потенциальные системные и местные биомаркеры, которые оценивались на основе их роли в патогенезе DR.

Воспаление и диабетическая ретинопатия

Воспаление играет важную роль в патогенезе DR, а хроническое воспаление низкой степени выраженности присутствует на разных стадиях DR. Он отвечает за повреждение сосудистой сети сетчатки и участвует в развитии обеих основных причин нарушения зрения при диабете: повышенной проницаемости сосудов сетчатки (DME) и неоваскуляризации (PDR) ( 4 — 6 , 9 — 15 , 18 ).

Диабет вызывает повышенное местное и системное производство множества воспалительных молекул, участвующих в развитии DR, таких как молекулы сосудистой адгезии, цитокины, хемокины, транскрипция и факторы роста ( 5 , 9 — 15 , 18 — 42 ). Повышенные концентрации этих молекул вызывают активацию и миграцию лейкоцитов и лейкостаз ( 4 , 40 , 41 ) с последующей окклюзией капилляров, гипоксией сетчатки и повреждением эндотелиальных клеток.Результатом этих действий является разрушение гемато-ретинального барьера (BRB), что приводит к отеку сетчатки, кровотечениям, экссудату и образованию микроаневризмы ( 4 , 10 , 12 , 14 , 15 , 18 ). Активированные перициты также участвуют в воспалительных процессах сетчатки при развитии ДР. Они выделяют провоспалительные медиаторы, которые направляют и накапливают иммунные клетки к месту воспаления сетчатки ( 42 ).Появляется все больше доказательств того, что нейродегенерация сетчатки может быть релевантным патофизиологическим механизмом развития ДР ( 10 , 31 , 43 ). Глиальные клетки сетчатки, включая астроциты, клетки Мюллера и микроглию, отвечают за обеспечение структурной поддержки и поддержание гомеостаза в сетчатке ( 43 ). Их дисфункция участвует в раннем воспалительном процессе сетчатки при DR ( 12 ). Гипергликемический стресс вызывает активацию клеток микроглии ( 43 ).Нейродегенерация сетчатки и апоптоз нейронов, развивающиеся на ранних стадиях ДР, вызывают истончение слоя нервных волокон и, как следствие, ухудшение зрения и потерю зрения ( 15 ).

Воспалительное и ангиогенное взаимодействие при диабетической ретинопатии

Ангиогенез — это хорошо контролируемый процесс, регулируемый балансом проангиогенных (VEGF) и антиангиогенных эндогенных факторов ( 23 , 44 ). Во время этого процесса происходит миграция и пролиферация эндотелиальных клеток с созреванием и ремоделированием кровеносных сосудов, а также деградация внеклеточного матрикса.Деградация внеклеточного матрикса является очень важной частью этой деятельности, поскольку она регулирует весь процесс ( 15 , 18 , 22 , 23 , 45 ).

Проангиогенный дисбаланс вызывает аномальный рост новых хрупких и протекающих кровеносных сосудов, а именно неоваскуляризацию (NV) ( 18 ). Одной из основных причин NV сетчатки является ишемия, однако воспалительные клетки также могут участвовать в ангиогенных процессах, продуцируя ангиогенные цитокины и факторы роста ( 18 , 41 , 44 ).Эндотелий микрососудов, активированный цитокинами и ангиогенными факторами роста, может экспрессировать провоспалительные молекулы, участвующие в мобилизации и активации лейкоцитов ( 10 , 18 , 44 — 46 ). Неоваскуляризация и воспаление имеют несколько общих медиаторов и сигнальных путей ( 18 , 44 ). Некоторые хемокины могут действовать как аттрактанты лейкоцитов и как ангиогенные индукторы, влияющие на эндотелиальные клетки ( 18 , 22 , 23 , 44 — 46 ).Таким образом, ангиогенез и воспаление взаимосвязаны, и можно предположить, что воспаление участвует как на ранних, так и на поздних стадиях DR, характеризующихся повышенной проницаемостью и NV ( 18 , 44 ).

Роль биомаркеров в лечении диабетической ретинопатии

Биохимические биомаркеры — это молекулы, обнаруженные в крови или других биологических жидкостях и тканях, свидетельствующие о наличии ненормального состояния или заболевания, однако также могут быть индикаторами нормальных биологических процессов.Они могут помочь в выявлении лиц с повышенным риском развития заболевания, пациентов с ранними формами заболевания, лиц с тенденцией к прогрессированию заболевания, а также в мониторинге эффективности лечения ( 16 , 17 , 47 — 49 ).

Биомаркеры DR в системном кровотоке или местных тканях могут быть индикатором патологических процессов, связанных с DR, в зависимости от их роли в его развитии. Их можно измерить в крови, стекловидном теле, сетчатке, АГ и недавно в слезах (Таблица 1) ( 16 , 17 , 19 — 39 , 43 — 56 ).Преимущество определения биомаркеров в крови — доступность и больший объем образца, рутинные процедуры сбора и стандартизованные аналитические методы, а также возможность повторного анализа. Однако, поскольку сетчатка представляет собой небольшую часть общей массы тела, циркулирующий биомаркер DR должен быть очень специфичным, чтобы иметь значение. Местные биомаркеры представляют собой более точные индикаторы патологии сетчатки. Однако они доступны только во время хирургических процедур, а получение образца АГ или стекловидного тела является инвазивной процедурой с возможными серьезными осложнениями, влияющими на зрительную функцию.Дополнительной проблемой с местным образцом является небольшой размер образца и отсутствие стандартизированных аналитических методов и проверки данных ( 17 , 21 — 23 , 46 , 50 , 51 ). Некоторые клинические и биохимические биомаркеры, такие как гликемия, HbA1c, артериальное давление, концентрация липидов в крови и когерентная томография глаза (ОКТ), обычно используются в качестве биомаркеров при наблюдении за пациентами с диабетом. Среди провоспалительных и ангиогенных факторов мы можем выделить VEGF, который позволил разработать лечение против VEGF ( 14 , 17 , 26 , 36 , 37 , 39 , 54 ).Многие другие молекулы используются в фундаментальных научных исследованиях, изучающих патогенез ДР, или в качестве суррогатных конечных точек в доклинических исследованиях, изучающих новые варианты терапии ( 6 , 47 , 48 ).

Таблица 1

Потенциальные системные и глазные биомаркеры диабетической ретинопатии

Поскольку существующие методы лечения ДР обычно применяются на поздних стадиях заболевания, необходимы надежные биомаркеры для раннего выявления, чтобы обеспечить своевременное лечение. Дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение новых биомаркеров DR, которые должны быть доступными, неинвазивными, экономичными и точными, чтобы оценить присутствие и прогрессирование DR ( 11 , 15 , 17 ).

Сбор и анализ образцов из глаз

Оценка биомаркеров в системном кровотоке (таблица 2) является рутинной процедурой на каждом этапе, в то время как тот же процесс с образцами из глаз представляет собой проблему. Ключевой проблемой, связанной с глазными биомаркерами, является сбор достаточного объема глазных образцов, таких как слезы, АГ и стекловидное тело для оценки (Таблица 3). Таким образом, важно оптимизировать сбор, хранение, обработку и анализ полученных образцов, чтобы максимально использовать их ( 47 , 48 ).Наиболее доступными образцами глаз являются слезы и конъюнктива, которые обычно предоставляют информацию, относящуюся к патологии переднего сегмента. Существуют исследования, в которых биомаркеры DR определялись в слезах, но в настоящее время таких исследований для конъюнктивы нет ( 29 , 30 , 54 ). Биомаркеры диабетической ретинопатии, которые более точно отражают патологию заднего сегмента глаза, определяются на основе АГ и стекловидного тела ( 47 , 48 ).Однако их трудно получить и они требуют инвазивных процедур для сбора образца ( 21 — 23 , 26 — 28 , 31 — 34 , 36 — 39 , 47 , 48 , 51 — 54 , 56 , 57 ).

Таблица 2

Потенциальные системные биомаркеры диабетической ретинопатии

Таблица 3

Потенциальные глазные биомаркеры диабетической ретинопатии

Слезы можно собирать несколькими неинвазивными методами с использованием абсорбирующих материалов, таких как полоски Ширмера, мини-губки, полированные огнем микрокапиллярные трубки и средства для промывания глаз. На различия в результатах, наблюдаемых между исследованиями, могут влиять различия в методах сбора и хранения образцов ( 47 ). Во время отбора проб слезной жидкости важно избегать активации нервов роговицы и рефлекторного разрыва, поскольку это может изменить состав слезной жидкости.Внешние факторы, включая использование местной анестезии, искусственные слезы, ношение контактных линз и методы сбора в целом, могут влиять на состав слезы и, таким образом, влиять на интерпретацию результатов ( 47 , 57 ).

В то время как слезы собираются неинвазивными методами, образцы АГ собираются инвазивно через водные краны во время операции по удалению катаракты или трабекулэктомии. Объемы сбора варьируются от 0,1 до 0,25 мл и в большинстве случаев могут быть достаточными только для теста на одну молекулу, что может привести к ложноотрицательному результату ( 58 ).Контакт с другими структурами глаза во время процесса сбора может повлиять на результаты из-за загрязнения образцов белками, не относящимися к AH ( 47 ).

Для получения большей пробы внутриглазной жидкости требуется отбор проб стекловидного тела, который обычно содержит 1-2 мл. Этот образец также берут инвазивно через точек стекловидного тела во время витрэктомии, путем аспирации иглой или сбора рефлюксов стекловидного тела с помощью полосок Ширмера, микрогубок и миллипоровых фильтров после интравитреальных инъекций ( 47 , 59 ).

Из-за небольшого объема глазного образца и ограничений самого процесса отбора образцов важно установить руководящие принципы для стандартизации методов сбора, его обработки и хранения, чтобы можно было проводить сравнение исследований и повысить надежность собранных данных. Исследования, проведенные для оценки целостности и воспроизводимости образцов, показали, что продолжительность хранения образцов должна быть ограничена от нескольких дней до нескольких недель ( 47 ). Новые белковые и генные технологии улучшают чувствительность и позволяют оценивать несколько биомаркеров в небольших объемах слезы, АГ или стекловидного тела.Совершенствование аналитических методов открывает новые возможности для использования одного образца для оценки нескольких биомаркеров, что дает последовательные и надежные результаты ( 47 , 59 ).

Воспалительные биомаркеры диабетической ретинопатии

Учитывая, что воспаление играет важную роль в патогенезе ДР, воспалительные биомаркеры были интенсивно исследованы ( 10 , 17 , 22 , 24 , 44 — 46 , 49 — 52 ).Различные провоспалительные факторы, такие как цитокины и хемокины, были идентифицированы в повышенных концентрациях в глазной жидкости и тканях, а именно сетчатке, стекловидном теле, АГ и слезах, а также в системном кровотоке, которые могут быть полезны в качестве потенциальных биомаркеров DR ( 19 — 39 , 52 — 54 , 59 — 77 ).

С-реактивный белок

C-реактивный белок (CRP) — это белок острой фазы, а также маркер воспаления и повреждения тканей.Он вырабатывается в печени и жировой ткани в ответ на активность интерлейкина 6 (IL-6), IL-1β и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) ( 9 , 14 ). Роль CRP в патогенезе DR широко изучалась, однако клинические исследования, связанные с ассоциацией между концентрациями CRP в сыворотке и плазме и DR, дали различные результаты. Некоторые исследования подтвердили, что концентрации CRP связаны с DR при обоих типах DM, в то время как другие дали противоположные результаты ( 13 , 49 — 51 , 60 , 78 ).Несколько исследований показали более высокие концентрации CRP у пациентов с PDR по сравнению с пациентами с NPDR, и эти результаты могут поддержать результаты метаанализа Song et al . что указывает на то, что концентрация CRP может использоваться в качестве биомаркера тяжести DR ( 13 , 19 , 49 — 51 , 60 , 78 ). Однако следует уточнить результаты, касающиеся значения CRP как биомаркера DR из-за неубедительных результатов.В поперечном исследовании с участием 24 пациентов с PDR, проведенном Mallmann et al. ( 31 ) были обнаружены повышенные концентрации СРБ в стекловидном теле по сравнению с контрольной группой из 31 пациента без диабета. Концентрация СРБ в стекловидном теле составляла 6,0 ± 2,3 пг / мл, что аналогично концентрациям, обнаруженным в сыворотке крови, описанным Tomić et al. (5,4 ± 5,8 пг / мл) и Zorena et al. (2,3 ± 1,0 пг / мл) ( 19 , 50 ).

Фактор некроза опухоли-α

Фактор некроза опухоли-α представляет собой провоспалительный цитокин, который увеличивает адгезию лейкоцитов к эндотелию сетчатки и лейкостаз, продукцию активных форм кислорода (АФК), проницаемость эндотелиальных клеток сетчатки и участвует в BRB ( 4 , 46 , 61 ).Повышенные концентрации TNF-α были вовлечены в развитие нескольких хронических воспалительных заболеваний ( 9 , 49 ). Текущие исследования показали, что пациенты с СД имеют более высокие сывороточные концентрации TNF-α, чем здоровые контрольные, и эти концентрации коррелируют со стадией DR, причем самые высокие концентрации обнаруживаются у пациентов с PDR ( 20 , 49 ). Кроме того, в стекловидном теле пациентов с диабетом были обнаружены повышенные концентрации TNF-α и экспрессия TNF-α в эпиретинальных мембранах пациентов с PDR.Это подтверждает важность местного производства TNF-α для развития DR ( 20 , 46 , 61 , 62 ). В перекрестном исследовании с участием 100 участников Zorena et al. обнаружил, что риск NDR в педиатрической популяции сильно коррелировал с концентрацией TNF-α в сыворотке ( 50 ). В обсервационном исследовании с участием 86 пациентов Kocabora et al. сообщил о повышенных концентрациях TNF-α в сыворотке и АГ у пациентов с DME по сравнению со здоровым контролем ( 51 ).Новый подход в области диагностики ретинопатии — это оценка медиаторов воспаления в слезах ( 53 , 54 ). Измерение TNF-α в слезах в проспективном исследовании, проведенном Costagliola et al. показал, что концентрации TNF-α были ниже в контрольной группе, чем у пациентов с диабетом, при этом его концентрация коррелировала с тяжестью DR ( 53 ).

Интерлейкин-6

Интерлейкин-6 представляет собой многофункциональный цитокин, который регулирует воспаление и иммунные ответы, воздействуя на различные типы клеток, включая лейкоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты ( 20 , 25 , 52 , 63 ).Он участвует в увеличении проницаемости сосудов и стимуляции ангиогенеза прямо и косвенно, индуцируя экспрессию VEGF ( 9 , 64 ). Путь передачи сигналов IL-6 вовлечен в патогенез нескольких воспалительных заболеваний глаз, включая DR, и эта связь хорошо задокументирована ( 20 , 22 , 23 , 28 , 32 , 52 , 63 , 64 ). Концентрации ИЛ-6 в стекловидном теле связаны с развитием ДР и коррелируют с тяжестью ретинопатии, особенно с ПДР и ДМО ( 4 , 9 , 20 , 63 , 65 ).Кроме того, несколько исследований показали положительную корреляцию между концентрацией IL-6 в сыворотке крови и наличием и стадией DR при обоих типах DM ( 20 , 63 , 65 , 66 , 75 ). В поперечном исследовании с участием 159 пациентов с DM Shimizu et al . обнаружили, что сывороточные концентрации IL-6 также значительно связаны с тяжестью ME и могут быть предиктором PDR ( 75 ).

Интерлейкин-1 бета

Интерлейкин-1 бета является ключевым провоспалительным цитокином, секретируемым в основном моноцитами и макрофагами, который играет важную роль в воспалительных процессах, участвующих в развитии DR ( 46 , 64 ).Интерлейкин-1 бета — нестабильная молекула, и, поскольку ее трудно обнаружить с помощью коммерческих наборов, существует лишь несколько проведенных исследований. Результаты этих исследований показали повышенные концентрации IL-1β в сыворотке и глазных жидкостях пациентов с DR и DME ( 20 , 27 , 46 , 62 , 65 ).

Интерлейкин-8

Интерлейкин-8 или CXCL8 — провоспалительный хемокин, который действует как активатор и стимулятор хемотаксиса нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов и является мощным промотором ангиогенеза.Повышенные концентрации IL-8 были обнаружены в сыворотке, а также в стекловидном теле и АГ пациентов с PDR и DME, играющих определенную роль в формировании ME, связанного с диабетом ( 20 , 27 , 28 , 33 , 36 , 46 , 64 ).

Молекулы клеточной адгезии

Молекулы клеточной адгезии (CAM) участвуют в лейкостазе, в процессах ангиогенеза и играют роль в развитии сосудистых осложнений ( 41 , 46 , 76 ).Они увеличиваются в экстраокулярных сосудах и сосудах сетчатки даже на ранних стадиях диабета и DR, вызывая повышенную адгезию лейкоцитов, сосудистую утечку, капиллярную неперфузию и повреждение эндотелиальных клеток ( 45 , 46 ). Наиболее важными CAM являются молекула внутриклеточной адгезии-1 (ICAM-1), молекула адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1) и E-селектин, которые присутствуют в высоких концентрациях в стекловидном теле пациентов с PDR ( 66 , 67 ). Концентрации ICAM-1 в стекловидном теле еще выше у пациентов с активными формами PDR ( 66 ).Экспрессия ICAM-1 повышена в сосудах сетчатки и хориоидеи, а также в фиброваскулярных мембранах пациентов с диабетом, облегчая мобилизацию лейкоцитов ( 69 ). В проспективном исследовании с участием 725 афроамериканцев с СД 1 типа Roy et al. показал связь между исходными концентрациями ICAM-1 в плазме с DME и исходной концентрацией E-селектина в плазме с прогрессированием DR ( 69 ). E-селектин и VCAM-1 также участвуют в патогенезе DR и могут действовать как ангиогенные факторы на эндотелиальные клетки с прямой положительной корреляцией между VCAM-1 и концентрацией VEGF ( 18 , 41 , 44 , 67 , 70 ).Было обнаружено, что растворимые формы молекул сосудистой адгезии повышены в стекловидном теле и сыворотке пациентов с PDR ( 67 , 70 ). Их продукция увеличивалась в присутствии высоких концентраций глюкозы и провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-1β ( 9 , 46 , 69 ). Тем не менее, некоторые исследования ставят под сомнение прямое участие САМ в патогенезе DR, и поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения их точной роли ( 6 , 10 , 12 , 14 ).

Ретинол-связывающий белок 4

Ретинол-связывающий белок 4 (RBP4) представляет собой адипокин, секретируемый гепатоцитами и жировой тканью, который действует как специфический переносчик витамина А ( 71 ). Предыдущие исследования показали, что сывороточные концентрации RBP4 были связаны с инсулинорезистентностью, метаболическим синдромом, нарушением толерантности к глюкозе и диабетом 2 типа ( 72 — 74 ). Он также был связан с воспалительными факторами, такими как CRP и IL-6 ( 74 ).На животной модели было показано, что его сверхэкспрессия связана с ранним началом активации микроглии, прогрессирующей дегенерацией сетчатки и повышенной экспрессией про-ИЛ-18 ( 77 ). В поперечном исследовании Li et al. обнаружил связь повышенных концентраций RBP4 в плазме с DR и угрожающим зрению DR (VTDR) у 92 китайских пациентов с диабетом 2 типа, что указывает на его возможную роль в патогенезе осложнений DR ( 78 ). Поскольку RBP4 стимулирует экспрессию провоспалительных молекул в клетках сетчатки человека, он может быть частью воспалительного патогенетического процесса развития DR и может рассматриваться как биомаркер ранних стадий ретинопатии ( 71 , 77 ).

Биомаркеры, связанные с ангиогенезом

Ангиогенез — это процесс, включающий развитие новой сосудистой сети из ранее существовавших кровеносных сосудов. Он характеризуется аномальным образованием новых сосудов, что приводит к гипоксии и утечке сосудов ( 9 , 15 , 18 , 44 ). Неоваскуляризация сетчатки представляет собой типичный признак PDR. В процессе ангиогенеза задействованы многочисленные медиаторы, некоторые из которых считаются потенциальными биомаркерами DR ( 18 , 22 , 32 , 33 , 49 , 63 — 65 , 79 — 100 ).

Фактор роста эндотелия сосудов

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) представляет собой гликопротеин из семейства факторов роста, который действует как эффективный индуктор сосудистой проницаемости сетчатки и ангиогенеза. Он считается основным ангиогенным фактором роста, участвующим в развитии DR ( 79 ). Семейство VEGF состоит из шести белков: VEGF-A, -B, -C, -D, -E и фактор роста плаценты (PGF), причем VEGF-A является наиболее известным и наиболее широко используемым в клинической практике ( 80 ).VEGF индуцирует экспрессию ICAM-1 в сетчатке и адгезию лейкоцитов сетчатки, что приводит к разрушению BRB, неперфузии капилляров и повреждению эндотелиальных клеток. Дисбаланс между VEGF и активностью ангиогенного ингибитора приводит к аберрантному ангиогенезу и пролиферации в сетчатке пациентов с СД. Результаты текущих исследований показывают значительную корреляцию VEGF в сыворотке и стекловидном теле с DR и DME ( 22 , 24 , 26 , 37 , 54 , 63 , 65 , 82 — 86 ).Фактор роста эндотелия сосудов и его рецептор были обнаружены на эпиретинальной мембране в глазах пациентов с диабетом, и была установлена ​​корреляция между концентрациями VEGF и активностью ретинопатии ( 37 , 82 ). Мета-анализ, проведенный Zhou et al. показали, что концентрации VEGF в сыворотке коррелируют с наличием и тяжестью ретинопатии у пациентов с диабетом, и был сделан вывод о том, что сывороточный VEGF может быть потенциальным биомаркером для оценки развития и прогрессирования DR ( 84 ).Однако при интерпретации результатов необходимо учитывать, что на концентрацию VEGF в сыворотке может влиять активация тромбоцитов ( 84 ). Оценка VEGF в слезах представляет собой прогресс в скрининге и диагностике DR ( 29 , 30 , 51 ). Ang et al. в сравнительном поперечном исследовании оценил концентрацию VEGF в слезах у 88 пациентов с СД 2 типа ( 54 ). Образцы слез собирали с помощью полосок Ширмера и измеряли иммуноферментным анализом.Средние концентрации VEGF в слезе были значительно выше в группах NPDR и PDR (114,9 ± 8,6 пг / мл и 149,5 ± 10,4 пг / мл соответственно) по сравнению с группой без DR (41,2 ± 11,3 пг / мл, P <0,001) предполагая значительную связь с тяжестью DR.

Фактор роста плаценты

Фактор роста плаценты (PGF) как член семейства VEGF участвует в патологическом ангиогенезе, особенно в заболеваниях сетчатки. Он может увеличивать активность VEGF в низких концентрациях и косвенно стимулировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток ( 9 , 83 ).Повышенные концентрации PGF наблюдаются в стекловидном теле пациентов с PDR, причем эти концентрации достоверно коррелируют с концентрацией VEGF ( 38 , 39 , 79 ). Модели на животных показывают, что PGF опосредует как проницаемость, так и NV, а также воспаление, что позволяет предположить, что PGF играет важную роль в аберрантном ангиогенезе ( 86 ). Исследования с участием пациентов с диабетическим заболеванием сетчатки показали, что лечение, ингибирующее как VEGF, так и PGF, дает лучшие результаты по сравнению с лечением, ингибирующим только VEGF ( 88 ).

Фактор, происходящий из пигментного эпителия

Фактор, происходящий из пигментного эпителия (PEDF), представляет собой гликопротеин с нейропротекторным, нейротрофическим и антиангиогенным, а также противовоспалительным и антиоксидантным действием ( 89 , 94 ). Он может ингибировать ангиогенез, напрямую уменьшая экспрессию гена VEGF и косвенно, увеличивая действие активности комплекса гамма-секретазы на VEGF-рецептор 1 (VEGFR-1) ( 94 ). Фактор, полученный из пигментного эпителия, подавляет продукцию ROS, хемотаксического протеина-1 моноцитов (MCP-1), и нейтрализует повреждающее действие конечных продуктов гликирования.Экспериментальные исследования показывают, что PEDF подавляет неоангиогенез в условиях, когда концентрация кислорода в крови является нормальной, и стимулирует его в условиях гипоксии ( 89 , 90 ). Предыдущие исследования показали, что концентрация PEDF была ниже в глазах с DR, особенно в глазах с PDR. В стекловидном теле пациентов с PDR концентрация растворимого VEGF-R1 (sVEGF-R1) была значительно выше, в то время как концентрация PEDF была ниже по сравнению с пациентами с диабетом и без признаков ретинопатии ( 91 ).Эти данные показали, что пониженная концентрация PEDF в глазах может быть вовлечена в прогрессирование DR и степень NV сетчатки ( 91 , 92 ).

Инсулиноподобный фактор роста-1

Инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) представляет собой полипептидный гормон, который имеет структуру и функции, аналогичные инсулину, и вырабатывается и секретируется в печени, фибробластах и ​​хондроцитах. Он регулирует пролиферацию и дифференцировку нескольких типов клеток ( 93 ).Он участвует в регуляции, росте, созревании и функционировании кровеносных сосудов и играет важную роль в патогенезе DR. Митотический эффект IGF-1 является основной причиной роста и пролиферации эндотелиальных клеток сосудов. IGF-1 участвует в активации VEGF в клетках RPE человека и вместе со своим рецептором (IGF-1R) участвует в патогенезе или прогрессировании пролиферативных витреоретинальных нарушений ( 14 , 15 ). Экспериментальные исследования показывают, что IGF-1 стимулирует выработку VEGF со значительно увеличенными концентрациями в глазах пациентов с PDR по сравнению с контрольной группой ( 9 , 93 , 94 ).

Трансформирующий фактор роста бета

Трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), член семейства трансформирующих факторов, обладает иммунорегуляторной активностью и усиливает ангиогенез и хондрогенез ( 94 ). Концентрация TGF-β показала связь с тяжестью микрососудистых осложнений и продолжительностью СД. У пациентов с глаукомой DR и NV были повышенные концентрации TGF-β в сыворотке ( 85 , 94 ). Исследования относительно его концентрации в АГ показали аналогичные результаты.Руснак и др. провели проспективное когортное исследование 61 глаза 56 пациентов, которое предположило, что концентрации АГ IL-6, TGF β -1 и VEGF коррелируют с тяжестью PDR ( 85 ). Пациенты с NV-глаукомой, которые были невосприимчивы к лечению, показали более высокие значения этих факторов, чем другие пациенты с PDR, что означает, что концентрации IL-6, TGF β -1 и VEGF коррелируют с тяжестью PDR. Однако из-за небольшой группы из десяти пациентов с глаукомой NV, эти конкретные результаты следует интерпретировать с осторожностью.

Основной фактор роста фибробластов

Основной фактор роста фибробластов (bFGF) — это фактор роста с митогеновой и антигенной активностью, участвующий в выживании и созревании нейронов и глиальных клеток, а также в восстановлении тканей ( 86 ). Нейротрофический фактор, происходящий из линии глиальных клеток, стимулирует выработку клетками Мюллера bFGF, который, в свою очередь, способствует пролиферации эндотелиальных клеток и продукции VEGF ( 9 , 95 ). Рецептор основного фактора роста фибробластов экспрессируется в сетчатке и, как известно, участвует в образовании эпиретинальных мембран и в патогенезе PDR ( 95 ).

Фактор роста гепатоцитов

Фактор роста гепатоцитов (HGF) и его рецептор модулируют подвижность, рост и морфогенез различных типов клеток и обладают ангиогенной активностью, вызывая образование капиллярно-подобных канальцев ( 97 , 98 ). В сыворотке и стекловидном теле пациентов с ПДР обнаружены повышенные концентрации HGF. Shinoda et al. в обсервационном исследовании сообщил, что HGF при АГ, полученный от 58 пациентов с диабетом во время офтальмологической хирургии, положительно коррелировал со стадией DR ( 99 ).Интравитреальные концентрации HGF у пациентов с PDR были значительно выше, чем концентрации, обнаруженные в контрольной группе. Canton et al. в своем наблюдательном исследовании пришел к выводу, что высокие концентрации HGF в стекловидном теле, наблюдаемые у 17 пациентов с диабетом с PDR, не вызваны диффузией сыворотки через BRB, а скорее предполагает, что внутриглазный синтез может быть основным фактором ( 98 ).

Интерлейкин-12

Интерлейкин-12 (IL-12) представляет собой цитокин, который стимулирует пролиферацию, активацию и цитотоксичность лимфоцитов Т и естественных киллеров (NK).Он также стимулирует эти клетки производить интерферон-гамма (INF-γ) и TNF-α. Несколько исследований показали, что IL-12 обладает антиангиогенным действием ( 21 , 27 , 28 , 94 ). Исследования in vitro показывают, что поддержание равновесия между провоспалительными и противовоспалительными факторами имеет решающее значение для поддержания физиологического ангиогенеза. Сдвиг этого баланса в пользу проангиогенных медиаторов вызывает патологический ангиогенез ( 81 , 94 ).Зорена и др. в поперечном исследовании с участием 126 пациентов обнаружили, что у детей с СД 1 типа и ретинопатией концентрация TNF-α в сыворотке была значительно выше, а концентрация IL-12 была значительно ниже, чем в группе без ретинопатии, что свидетельствует о повышенном TNF. Продукция -α может быть результатом недостаточной концентрации IL-12 ( 81 ). Они предположили, что баланс между про- и антиангиогенными цитокинами может быть одним из факторов, предотвращающих развитие ДР и нефропатии у детей с диабетом.Кроме того, в наблюдательном исследовании, проведенном Gverović-Antunica et al. , значительно более высокая концентрация IL-12 была обнаружена в АГ у нелеченных пациентов с DR по сравнению с диабетическими пациентами, леченными от ретинопатии, пациентами без ретинопатии или здоровыми людьми из контрольной группы. Поскольку сывороточные концентрации IL-12 существенно не различались между исследуемыми группами, был сделан вывод, что это могло быть связано с его местным продуцированием и секрецией ( 21 ).

Фактор роста соединительной ткани

Фактор роста соединительной ткани (CTGF) представляет собой цитокин, участвующий в стимуляции пролиферации, ангиогенеза, миграции, продукции внеклеточного матрикса, прикрепления клеток, выживания и апоптоза.Он представляет собой ключевой клеточный фактор, способствующий фиброзу, и несколько исследований показали, что он тесно связан с развитием фиброза DR. CTGF способствует образованию пролиферативных мембран в PDR и косвенно модулирует экспрессию VEGF. Более высокие концентрации CTGF и VEGF были обнаружены в стекловидном теле пациентов с PDR, а на стадии PDR соотношение CTGF и VEGF является сильным предиктором трансформации сосудистого фиброза ( 6 , 9 , 100 ).

Заключение

Воспаление и ангиогенез играют важную роль в патогенезе ДР.Сывороточные и глазные биомаркеры, которые позволяют оценить наличие воспалительных и ангиогенных процессов, представляют собой полезные инструменты для мониторинга появления и прогрессирования DR. В патогенезе DME и PDR VEGF играет важную роль, а лечение анти-VEGF является общепринятым методом терапии DR. Некоторые пациенты неудовлетворительно реагируют на лечение анти-VEGF, предполагая, что эти пациенты, хотя и имеют PDR, имеют неопределяемую концентрацию VEGF в стекловидном теле ( 55 ).Это также указывает на то, что VEGF-независимые пути могут играть основную роль в патогенезе DR у этих конкретных пациентов, и может быть эффективным улучшение терапевтических методов для блокирования других провоспалительных и проангиогенных факторов. Идентификация надежных и доступных биомаркеров DR предоставит ценную информацию, которая может быть использована для разработки новых терапевтических стратегий с применением индивидуального подхода. В этом отношении циркулирующие или глазные биомаркеры могут быть особенно полезными для выявления пациентов, которым будет полезна существующая терапия.На основе этого могут быть разработаны новые методы лечения, направленные на индивидуальную медицину.

Ограничениями при поиске биомаркеров DR может быть тот факт, что их концентрации в плазме могут отражать системные эффекты диабета, а не специфические повреждения сетчатки. Таким образом, акцент следует сместить на оценку циркулирующих концентраций тех, которые экспрессируются преимущественно в глазах. Глазные жидкости, особенно водянистая влага и стекловидное тело, более надежно отражают патофизиологические механизмы развития ДР, однако получение этих образцов может быть связано с серьезными осложнениями ( 21 — 23 , 46 , 51 , 52 ).Поскольку анализ слезы легко доступен, он становится многообещающим инструментом для идентификации биомаркеров. Несколько исследований подтверждают корреляцию между концентрацией некоторых биомаркеров, в частности TNF-α и VEGF в слезах, и степенью DR ( 53 , 54 ). Обнаружение этих биомаркеров в слезах может быть хорошим неинвазивным тестом для ранней диагностики и предиктором тяжести DR. На сегодняшний день провоспалительные и ангиогенные молекулы используются в фундаментальных научных исследованиях, и ожидается, что на основе обширных исследований по крайней мере некоторые из этих биомаркеров в будущем будут использоваться в повседневной клинической практике ( 47 , 48 ) .Учитывая тот факт, что различные провоспалительные и проангиогенные факторы, особенно те, которые мы оценили, были вовлечены в патофизиологию DR, это открывает новую область для будущих исследований по обнаружению биомаркеров DR.

Высокие уровни циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников у пациентов с диабетической ретинопатией положительно связаны с экспрессией ARHGAP22

ВВЕДЕНИЕ

Диабетическая ретинопатия (DR) является частым микрососудистым осложнением диабета и остается основной причиной потери зрения в развивающихся странах среди трудоспособного возраста. частные лица [1].Плохой гликемический контроль, большая продолжительность диабета, артериальной гипертензии, гиперлипидемии и альбуминурии указываются как факторы риска развития ДР [2–7]. DR, основанная на отсутствии или наличии неоваскуляризации, состоит из двух стадий: более ранняя стадия непролиферативной DR (NPDR) и более поздняя стадия пролиферативной DR (PDR). Стадия PDR характеризуется индуцированной ишемией и вызванной воспалением неоваскуляризацией, сочетающейся с фиброзными реакциями в сетчатке и геле стекловидного тела. Кроме того, предполагается, что эндотелиальные клетки сосудов сетчатки участвуют в рекрутинге и пролиферации стадии PDR.

Циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦИК) отделяются от эндотелиальных клеток поврежденного эндотелия и циркулируют в периферической крови [8]. Сообщалось, что уровни ЦИК и количество апоптотических ЦИК отражают степень повреждения эндотелия [9, 10]. Циркулирующие эндотелиальные клетки-предшественники (ЕПК) мобилизуются из костного мозга, и считается, что они играют важную роль в восстановлении кровеносных сосудов и способствуют реперфузии ишемической области [11]. Предыдущие исследования показали, что циркулирующие EPC повлияли на количество и количество осложнений у пациентов с диабетом 1 и 2 типа (T1D и T2D, соответственно) [12–15].Поскольку диабет чрезвычайно повреждает эндотелий капилляров сетчатки, циркулирующие EPC могут играть важную роль в реперфузии сосудов и регенерации ткани сетчатки. Тем не менее, сообщалось о противоречивых результатах относительно уровней EPC у пациентов с диабетом и пациентов с DR. Предыдущие исследования показали, что по сравнению с пациентами с легкой или легкой степенью DR или здоровыми пациентами, уровни EPC либо снизились, либо увеличились среди пациентов с тяжелой DR [16–21].

Ранее мы идентифицировали генетическую ассоциацию для восприимчивости к DR в Rho GTPase Activating Protein 22 ( ARHGAP22) [22], который кодирует негативные регуляторы Rho GTPase ras-родственного субстрата 1 ботулотоксина C3 (Rac1).Кроме того, он участвует в пути передачи сигнала, который регулирует образование капиллярных трубок эндотелиальных клеток во время ангиогенеза [23]. Уровни экспрессии ARHGAP22 играют важную роль в определении режима движения опухолевых клеток [24]. Недавний отчет также предположил, что ARHGAP22 связан с повышенным риском СД2 и может функционировать как регулятор инсулина [25]. ARHGAP22 — инсулино-чувствительный и связывающий 14-3-3 белок; сообщалось, что инсулин, глюкоза и факторы роста, такие как фактор роста тромбоцитов, увеличивают связывание белка 14-3-3 с ARHGAP22, что, в свою очередь, способствует модуляции активности Rac1 [26].Более того, активация транскрипции Rac1 была обнаружена в сетчатке на ранних стадиях DR [27]. Предыдущие сообщения показали, что Rac1 через активацию никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) оксидазы играет решающую роль в индуцированном гипергликемией апоптозе кардиомиоцитов [28, 29]. В недавнем сообщении было высказано предположение, что взаимодействие между конечными продуктами гликирования и их рецепторами индуцировалось активацией NADPH оксидазы / Rac1 и приводило к активации пути N-концевой киназы C-jun, что приводило к апоптозу и дисфункции EPCs [30].

Хотя повреждение эндотелиальных клеток является отличительной чертой DR, трудно измерить локальное повреждение эндотелиальных клеток сетчатки в периферическом кровообращении с использованием ЦИК и апоптотических ЦИК в качестве маркеров повреждения эндотелия. Чтобы изучить набор EPC из костного мозга, наиболее важный маркер для восстановления поврежденного сосуда и стимулирования ангиогенеза, мы сначала измеряем уровни EPC в этой популяции. Поэтому мы сосредоточились на оценке взаимосвязи между уровнями EPC и экспрессией ARHGAP22 у пациентов с СД2 с ДР.Здесь мы набрали пациентов с T2D с DR для исследования взаимосвязи между экспрессией ARHGAP22 и Rac1 и уровнями EPC, стратифицированными по степени тяжести DR.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Демографические и клинические характеристики субъектов исследования

В исследование были включены 50 пациентов с СД2 с диагнозом ДР, диагностированным офтальмологом; 21 (42,0%) и 29 (58,0%) имели NPDR и PDR соответственно. Не было значительных различий по полу, возрасту на момент постановки диагноза, продолжительности диабета, значениям гемоглобина A1c (HbA1c), индексу массы тела (ИМТ), систолическому артериальному давлению (САД), диастолическому артериальному давлению (ДАД) и курению между пациентами. с NPDR и PDR (Таблица 1, P > 0.05).

Таблица 1: Характеристики и клинические профили субъектов исследования